D Arabinose를 생산하는 방법?

D 아라비니톨은 지의류 식물과 일부 식품 유래 균류에서 널리 발견되는 중요한 천연 산물이다.그러나 천연함량이 낮고 전통적인 공정에서 대량의 원료를 수요하므로 경제적효익에 심각한 영향을 주며 대규모생산에는 적합하지 않다 [1,2].화학적 촉매 방법은 니켈을 촉매로 하여 산화환원 반응을 일으켜 아라비노스를 환원시켜 d-아라비니톨을 생성한다.이것은 d-아라비니톨 [3]의 산업적 생산을 위한 현재 가장 주류적인 방법이다.화학 촉매 방식이 시장에서 산업 규모를 달성할 수 있고 생산 기술이 비교적 성숙되어 있지만 생산 공정에서는 고가의 촉매를 사용하고 고온 (100°C)과 고압 (40~60 bar) [4] 등의 조건을 엄격하게 제어해야 한다.이는 환경을 오염시킬 뿐만 아니라 후속 제품의 분리 및 정화를 어렵게 하여 [5] 높은 생산비용을 초래한다.

화학적 촉매 방법에 비해 D-arabinitol의 생물학적 생산에 필요한 생산 조건이 더 완만합니다.미생물의 성장과 대사에 의해 물질의 전환이 이루어지고, 얻어진 산물은 분리 및 정화가 용이하며, d-아라비니톨의 순도와 수율을 향상시킬 수 있어 [6, 7] 친환경적이고 경제적이며 환경 친화적이라는 컨셉에 더욱 부합한다.생물학적 방법에는 크게 미생물 발효와 휴지 세포 변환 두 가지가 있다.미생물 발효법은 주로 미생물의 성장과 대사 중에 글리세롤, 자일로스, 락토오스, 포도당, 자일리톨 등의 기질을 전환시켜 d-아라비니톨을 생성한다 [8, 9].휴지 세포 형질전환법은 주로 배양된 세균액을 채취하고 농축하여 휴지 세포를 준비하는 것에 의존하며, 휴지 세포 내에 존재하는 다양한 효소를 이용하여 D-arabinitol을 전환한다.

요약하면, D-arabinitol을 생산하는 방법들은 각각 고유한 특징을 가지고 있으나, 생물학적 방법은 미생물의 정상적인 성장과 대사를 통해 물질의 전환이 이루어지기 때문에 친환경적이고 경제적이며 친환경적인 장점이 있다.또한 생물학적 방법의 생성물은 분리 및 정제가 용이하여 D-arabinitol의 순도와 수율을 향상시킨다.아직은 화학적 촉매 방법이 주된 생산 방법이지만 생물학적 방법이 더 유망한 대안이 되었거나 되고 있다.

1. D-arabitol의 생물학적 생산의 현재 연구 현황

고삼투압 내성효모는 d-아라비톨을 생산할 수 있는 자연계의 주요 미생물이다.높은 삼투압 하에서 효모세포는 폴리올을 합성, 축적하여 탈수 스트레스에 대처함으로써 손상으로부터 세포를 보호한다.1956년 스펜서 등은 삼투압에 내성이 있는 효모가 포도당의 발효를 통해 다양한 폴리올을 만들어낼 수 있다는 것을 발견했는데,이 중 D-arabitol[10]이 포함된다.1969년 오니시 등은 포도당이 미생물의 작용으로 자일리톨로 전환될 수 있으며, d-아라비니톨이 중간생성물임을 발견하였다 [11, 12].이 발견은 자일리톨의 생물학적 생산에 이론적 토대를 마련했으며 국내외 학자들의 광범위한 주목을 받았다.

현재,에 대한 연구D-arabinitol의 생산주로 변형 선별과 발효 조건 최적화에 초점을 맞춘다.예를 들어 송웨이빈 등은 꽃가루로부터 D-arabinitol을 생산하는 Saccharomyces cerevisiae 균주를 걸러내고, [12] 발효 조건을 최적화한 후 전환율을 향상시켰다.Li Ze 등은 높은 삼투압에 저항성이 있고 D-arabinitol을 생성하는 토양미생물로부터 Pichia pastoris L-84 균주를 분리하고, 발효기에서 대규모 발효를 수행하였다 [13].Saha 등은 야생 벌집으로부터 스크리닝하여 얻은 Rhodotorula glutinis NRRLY-27624 균주를 이용하여 발효 조건을 최적화하고 최종적으로 포도당의 발효에 성공하여 D-arabinitol을 생산하였으며, 전환율은 48% [14][15] 이었다.

Zhang Lili는 Debaryomyces hansenii 로부터 D-arabitol의 고수율 균주를 성공적으로 분리하고 D-arabitol 발효를 위한 운동 모델을 확립하였다 [16].Nozaki는 D-arabitol을 효율적으로 생산하는 Rhodotorula kofmei AJ14787 균주를 선별하였다.변온재배와 700 g/L 포도당을 연속공급하여 발효 최적화를 수행하였고, 최종적으로 206 g/L[17]를 발효하여 D-arabitol을 생산하였다.Cheng 등은 Pichia pastoris 계통에 적응진화를 적용한 결과, 야생형에 비해 생산량이 72.7% 증가하였다 [18].

M Povelainen 등은 D-arabitol을 생산하는 가공 세균 Bacillus subtilis ATCC31094를 제조하였는데, 전환효율이 최대 38%에 달하여 응용 가능성이 높다 [19].후속 연구자들은 칸 디속 [20], Kluyveromyces 속 [21], Kodamea 속 [22, 23], Hansenula 속 [24, 25], Debaryomyces 속 [26]이 D-arabitol[27]을 생산할 수 있다는 것을 발견하였다.

2. D-arabinitol의 생명공학 생산을 위한 대사 경로

현재 연구에서 포도당, 자일로스 [28], 글리세롤 [29, 30] 및 락토스 [31]와 같은 기질이 d-아라비니톨 생산에 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.포도당과 자일로스는 자연계에서 상위 2개의 탄소원 매장량 중 하나이며, 따라서 가장 비용 효율적인 기질로 널리 간주된다는 점에 주목할 필요가 있다.기존 연구 보고에 따르면, 포도당으로부터 d-아라비톨을 생산하는 대사 경로는 주로 두 가지 합성 경로를 포함하는 반면, 자일로스에서 d-아라비톨을 생산할 수 있는 대사 경로는 오직 한 가지, 자일리톨 경로만을 가지고 있다.D-arabitol의 세 가지 일반적인 대사 경로가 그림 1.2에 나와 있다.

그림 1.다라비톨의 대사 경로

포도당으로부터 다라비톨을 생산하는 대사 과정을 위해 두 가지 합성 경로가 존재하는데, 리불로스 경로와 자일룰로스 경로이다.이 과정에서 포도당은 먼저 글루코스 6-phosphate로 인산화되고, 리불로스와 자일룰로스 경로의 일반적인 전구체인 펜토스 인산 경로 (PPP 경로)를 통해 5-포스-d-리불로스로 전환된다.리불로스 키나아제에 의해 5-포스-d-리보스가 d-리불로스로 전환된 후 2-ArDH에 의해 d-아라비니톨로 전환되면 리불로스 경로를 형성한다.다른 대사 경로에서 5-포스-d-리보스는 d-자일룰로스-5-인산염으로 이성질화된 후 d-자일룰로스로 탈인산화된다.다음으로 d-아라비톨 4-디하이드로제네이스는 자일룰로스를 d-아라비톨로 전환시켜 자일룰로스 경로 [32]를 형성한다.

자일로스에서 d-아라비톨을 생산하는 대사 경로는 주로 합성 경로인 자일리톨 경로를 포함한다.이 과정에서 자일로스 환원효소는 먼저 자일로스를 자일리톨로 전환시킨다.이어서, 자일리톨 탈수소효소 (xylitol dehydrogenase, XDH)는 자일리톨을 D-xylulose로 환원시킨다.마지막으로 D-arabitol dehydrogenase (ArDH)는 D-xylulose를 D-arabitol로 전환시켜 자일리톨 경로의 합성을 완료한다.

요약하면, 포도당과 자일로스는 생체 공학 분야에서 흔하고 저렴한 두 가지 기질로서 펜토스 인산 경로, 자일루오스 경로 및 자일리톨 경로와 같은 다양한 경로를 통해 d-아라비니톨을 생산하는 데 사용될 수 있다.이러한 대사 경로는 연구자들에게 풍부한 생합성 전략을 제공하며, 이는 d-아라비니톨의 생산 공정을 더욱 탐색하고 최적화하여 실제 응용 분야에서 기능성 당알코올의 요구를 충족하는 데 도움이 될 것입니다.

3. 미생물 발효에 의한 D-Arabinitol 생성에 영향을 미치는 인자

발효과정에서 D-arabinitol의 수율은 다양한 요인에 의해 제한될 수 있다.현재 d-아라비니톨의 수율은 pH, 온도, 탄소 및 질소원 조성, 이노쿨럼 크기, 회전 속도 및 용존 산소 농도 등의 발효 조건을 최적화함으로써 효과적으로 증가시킬 수 있다 [33, 34].이러한 요인들은 생산 숙주의 대사 과정과 밀접한 관련이 있다.이러한 파라미터를 조정함으로써 이상적인 발효 조건을 설정하여 발효 수율을 높일 수 있습니다.

현재 D-arabinitol의 생물학적 생산에 관한 대부분의 연구는 포도당으로부터 D-arabinitol의 발효에 초점을 맞추고 있으며, 자일로스로부터 D-arabinitol의 생산에 관한 연구는 적다.포도당 생장 중에는 많은 효모가 D-arabinitol을 생산하는 것으로 알려져 있으나, 자일로스로부터 D-arabinitol을 생산하는 효모는 거의 알려져 있지 않다.2018년 Jagtap 등 [28]은 Rhodosporidium toruloides IFO0880이 질소가 풍부한 매질에서 자일로스로부터 d-아라비니톨을 생산할 수 있음을 처음 보고했다.이는 천연 효모가 자일로스를 유일한 탄소원으로 이용하여 D-arabinitol을 생산할 수 있다는 사실을 처음으로 밝혀낸 것으로, D-arabinitol의 생물학적 생산 대사과정에 자일리톨 경로가 존재함을 확인하였다.이 과정에서 자일로스는 먼저 자일로스 환원효소에 의해 자일리톨로 전환된다.이어서 XDH에 의해 자일리톨이 D-xylulose로 환원된다.마지막으로 ArDH는 d-자일룰로스를 d-아라비니톨로 변환시킨다.

초기 기질 농도가 높으면 발효 균주에 삼투압이 작용하여 전진 생물전환 반응을 촉진하고 이에 따라 D-arabitol의 수율을 높일 수 있다.예를 들어, Debaryomyces hansenii SBP-1의 발효 중에 150 g/L 자일로스를 사용할 경우 70 g/L 자일로스를 사용할 경우에 비해 D-arabitol의 수율을 2.23배 높일 수 있다.Debaryomyces hansenii NRRLY-7483로 발효하는 동안 1.5% glycerol을 사용하면 0.5% glycerol에 비해 d-아라비톨의 생성을 4~5배 증가시킬 수 있다 [35].Candida sp. H2 [36]의 생장 및 대사 중에 D-arabinitol의 생성은 포도당 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며, 250 g/L 포도당이 최적의 초기 당 농도였다.그러나 기질 농도가 너무 높으면 D-arabitol 합성에도 해로울 수 있다.예를 들어, Zygosaccharomyces rouxii JM-C46 재배시 포도당 농도가 200 g/L에서 250 g/L로 증가하였을 때 D-arabitol의 생산은 더 증가하지 않았다.

질소원은 미생물 발효시스템의 핵심 요소이며 미생물의 성장 및 대사 조절과 밀접한 관련이 있다.예를 들어, Candida sp. H2[37]와 Candida quercitrusa의 최적 질소원은 효모 추출물이며, 황산암모늄은 Pichia Manchurica[38]와 Debaryomyces Hansenii의 최적 질소원이다.Kumdam[39]과 Loman[40]은 중간체에 적절한 양의 질소원을 첨가하면 D-arabitol의 생산을 증가시킬 수 있음을 발견하였다.마찬가지로, Jagtap etal.은 Rhodosporidium toruloides IFO0880이 질소가 풍부한 미디어에서 d-아라비톨의 높은 역가를 생성하기 위해 자일로스를 변환 할 수 있음을 발견했다.D-arabitol의 수율은 매질 내 질소함량이 증가함에 따라 증가하였다.그러나 질소 농도가 높을 경우 Kluyveromyces ohmeri 균주에 의한 D-arabitol 생산에 해로울 수 있다 [41].

미생물발효시 적당량의 금속이온을 첨가하면 세포내액의 삼투압균형을 유지하고 세포내효소의 활성을 증진시키며 미생물의 성장과 대사를 촉진할수 있다.요시카와는 Candida quercitrusa에 의한 d-아라비니톨 생성에 대한 금속 이온의 영향을 연구했고 칼슘 이온이 d-아라비니톨의 생성을 촉진한다는 것을 발견했다.그 이유는 칼슘 이온이 세포 안으로 침투하여 세포 성장과 대사 경로에서 효소의 활동을 강화하기 때문입니다.다른 연구에서 Kumdam [42]과 Sundaramoorthy는 아연, 철, 망간 및 구리 이온이 Debaryomyces nepalensis와 Pichia Manchurica 계통의 성장 대사를 촉진하고 D-arabinitol의 생산을 증가시킬 수 있다는 것을 발견했다.

3.1 크실리톨 디 하이드로 게나제

Xylitol dehydrogenase는 D-arabinitol 생산을위한 생합성 경로에서 주요 속도 제한 효소입니다.XDH는 D-arabinitol을 생성하기 위해 미생물에 의한 자일로스의 대사에 중요한 역할을합니다.가역적 산화 환원 효소로서 XDH의 촉매 활성은 보조 인자인 NAD+와 NADH에 의존한다 [43, 44].

이 효소는 Paecilomyces taphios, Candida shehatae, Pichiastipitis [45]와 같이 자일로스를 발효시켜 자일리톨을 생성하는 효모에서 주로 발견된다.Fusarium oxysporum과 Neurospora crassa와 같은 실 모양의 균류 또한 XDH의 중요한 원천이다.서로 다른 종에서 나온 이들 XDHs의 활성 중심 서열이 매우 보존되어 있다는 점에 주목할 필요가 있다 [46].

Masakazu 등 [47]은 Gluconobacter oxycans ATCC621에서 XDH 유전자를 복제하였고, Zhang 등 [48]은 Gluconobacter oxycans NH-10에서 XDH 유전자를 복제하였으며, Qi 등 [49]은 Gluconobacter oxycans CGM CC 1.49에서 XDH 유전자를 복제하였다.

이들 연구자들은 서로 다른 균주의 XDH 유전자를 복제하여 Escherichia coli BL21에서 성공적으로 발현시켰다.또한 XDH의 효소적 특성을 연구하여 여러 공급원으로부터 이들 XDHs의 효소적 특성이 어느 정도 유사하다는 것을 발견하였다.추가 연구를 통해 XDH 가 단사 탈수소효소 계열에 속한다는 것이 밝혀졌다.NAD+를 조효소로 하는 자일리톨 산화 반응에서 XDH의 최적 pH는 11;NADH를 조효소로 하는 D-xylulose 환원반응에서 XDH의 최적 pH는 5이다.따라서 산화반응에서 XDH의 최적 pH는 알칼리성 범위이고, 환원반응에서 최적 pH는 산성 범위임을 추론할 수 있다.

요약하자면, XDH는 생물학적으로 중요하다.균주별로 XDH의 효소적 특성은 다양하지만 단백질 서열이나 효소적 성질에 있어서는 모두 어느 정도의 유사성을 공유한다.현재 연구를 통해 XDH는 반응조건에 따라 최적의 pH 값이 다르게 나타났으며, 이는 추후 효소의 연구 및 응용을 위한 기초자료를 제공하고 있다.

4분자 개조

XDH는 다양한 촉매 특성을 가지고 있으며 생체 분해에서 중요한 역할을 합니다.그러나 천연 효소는 활성, 기질 스펙트럼 및 촉매 특이성 측면에서 여전히 한계가 있어 이상적인 수준의 제품 수율을 달성하기가 어렵다.최근 단백질 공학적 전략인 방향진화 (directed evolution), 합리적 설계 (rational design), 반합리적 설계 (semi-rational design) 등이 효소변형에 널리 사용되고 있다.이러한 전략은 효소의 성능을 효과적으로 개선하여 실제 생산 수요를 더 잘 충족시킬 수 있습니다.

5 집-Directed Evolution

프랜시스 H. 아놀드 (Frances H. Arnold) 가 1993년 처음 주도진화론 (directed evolution)의 개념을 제안한 이후,이 분야는 최근 수십 년간 괄목할 만한 발전을 이루었다 [50].효소공학에서 중요한 역할을 하는 방향성 진화의 기본 개념은 자연적인 진화 과정을 시뮬레이션하고, 인공적인 무작위 돌연변이를 도입하고, 고성능 돌연변이를 선별하는 것이다.

또한 directed evolution strategy는 효소의 구조, 기능 및 촉매 메커니즘에 대한 깊은 이해 없이도 효소의 기능을 효과적으로 수정할 수 있다는 장점이 있다.주도적 진화 전략의 주요 단계에는 돌연변이 구축과 돌연변이 라이브러리 선별 작업이 포함됩니다.이 과정에서 랜덤 돌연변이 (random mutation)와 오류가 발생하기 쉬운 PCR, DNA 셔플링 (DNA shuffling) [51] 등의 유전자 재조합 기술을 사용한다.

이러한 기술의 적용으로 돌연변이 구축의 효율과 돌연변이 라이브러리의 다양성이 크게 향상되었다.그러나 방향성 있는 진화 전략의 구현은 특히 처리량이 많은 스크리닝 단계 [52]에서 몇 가지 도전에 직면한다.우수한 돌연변이를 빠르게 식별하고 선별하기 위한 방법으로서 높은 처리량 스크리닝 (High-throughput screening)은 directed evolution 과정에 매우 중요하다 [53].

특정 돌연변이 라이브러리에 대한고 처리량 스크리닝 방법은 대상 제품에 따라 특별히 설계되어야 하므로 보편적인 스크리닝 방법이 없다.이 단계의 심사 과정의 구체적인 설계와 과제는 지시된 진화 전략의 복잡성을 의심할 여지없이 가중시킨다.전반적으로, 고처리량 스크리닝 방법의 구체적인 설계와 도전에도 불구하고, 방향성 진화 기술은 여전히 효소의 분자 공학에 효과적인 도구로 여겨진다.이 분야의 중대한 기여와 지속적인 발전 추세는 생명공학 및 관련 분야에서 계속 중요한 역할을 할 것임을 보여준다.

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