효모 추출물로부터 Glutathione에 관한 연구

많은 연구에서 글루타치온의 생리 활성이 people&에 큰 가치가 있다는 것이 밝혀졌습니다#39;의 생산과 생활, 그리고 그것은 식품, 의약 및 보건 제품 등 다양한 분야에서 중요한 역할을했다.현재 글루타치온의 공업적 생산을 위해 가장 많이 사용되는 방법은 순수균주 발효법이며, 사용되는 균주는 주로 Saccharomyces cerevisiae와 Escherichia coli이다.순혈발효균주는 환경조건에 대한 요구가 비교적 거칠고, 발효시간이 비교적 길다.발효를 최적화하여 글루타치온 함량을 증가시키는 과정에서 글루타치온 수율의 증가는 균주 자체의 조건에 따라 이루어지기 때문에보다 높은 글루타치온의 수율을 얻기 위해서는 높은 수율을 가지는 균주의 선발에 노력해야 하며, 특정 기술적 수단 (돌연변이 육종 및 유전공학 교배육종 등)을 통해 글루타치온을 합성할 수 있는 균주의 능력을 향상시킬 필요가 있다.특정 기술 수단 (돌연변이 교배, 유전공학 교배 등)을 통해, 글루타치온을 합성하는 균주의 능력을 향상시킬 수 있습니다.이 방법은 공업생산에서 널리 리용되고있다.

Brewer's 효모는 영양소가 매우 풍부하며, 다량의 단백질, 필수 아미노산 및 소량의 RN한를 함유하고 있음이 밝혀졌으며, 효모세포의 세포벽에는 주로 글루칸과 망난 [87] 등 효모 다당류가 25~35% 함유되어 있다.최근 몇 년 동안, China&의 빠른 발전과 함께#39;의 양조 산업, 맥주 생산량은 해마다 증가했다.최신 데이터에서 China's 맥주 생산량은 2016년부터 2021년까지 약 3~4 천만 톤이 될 것이며 연간 맥주 생산량은 다른 나라에 비해 월등히 앞서고 있으며 매 200 t의 맥주는 3.0 t의 brewer&를 생산할 수 있다#39;s 효모 슬러지로 수분 함량이 약 80%이다.

이번 실험의 목적은 경제성과 환경보호의 관점에서 맥주 생산 후 신선한 맥주 효모로부터 직접 글루타치온을 생합성하는 것이다.본 실험의 장점은 발효 후 맥주효모의 폐세포를 이용하고, 효모를 미리 배양할 필요 없이 생리적으로 활성도가 높은 신선효모를 글루타치온 생산공정에 직접 다량 첨가하여 생산주기를 단축시키고 에너지를 절약할 수 있을 뿐만 아니라 맥주효모를보다 저렴하고 풍부하게 만들 수 있다.이 방법은 엄격한 재배조건을 필요로 하지 않으며 시간이 적게 들고 원가가 낮은 조건하에서 충분한 원료를 가지고 글루타치온의 합성을 진행할 수 있어 맥주제조업체에 더 많은 경제효익을 창출하고 자원의 유효이용을 실현할 수 있을 뿐만 아니라 중요한 경제, 사회적 효과인 자원낭비와 환경오염문제도 해결할 수 있다.

1. 소개

이효모 발효에 의한 glutathione의 생산국내외에서 연구되어 왔으며, 발효 방법은 분명한 장점이 있으며, 글루타치온 생산에 사용되는 균주는 주로 박테리아 또는 효모 세포이다.이런 세포는 배양하기 쉽고 취급이 간단하며 반응조건이 온화하다.따라서 발효는 글루타치온 생산을 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법이 되었습니다.

brewer&의 최적화#39;s 효모 배양공정은 glutathione 발효의 영양조건 및 환경인자를 중심으로 질소와 탄소원, 금속이온 농도 및 전구체 아미노산이 세포에 의한 glutathione의 합성에 미치는 영향을 알아보고자 한다.

글루타치온의 직접 합성에 대한 보고는 많지 않다 신선한 brewer&에서#39; 유두질 후 s 이스트.이 장에서는 배양성분, 배양조건 및 전구체 아미노산 첨가 전략이 brewer&에 의한 glutathione 합성에 미치는 영향#39;s 효모를 조사하여 글루타치온 생성을 향상시키기 위하여 일원최적화 실험과 반응표면분석 실험을 통하여 최적의 생합성 조건과 아미노산 첨가 전략을 알아보았다.

2.실험

2.1 실험재료

Brewer's 효모는 옌타이 무핑 양조장에서 제공하였다 (맥주 생산 후 양조장에서 신선한 효모).이후 the fresh brewer's 효모는 수명이 제한되어 있고 오래 두면 생리 활성을 잃기 쉽다, 장기적인 실험은 brewer&의 다른 배치를 사용할 필요가 있다#39;s 효모는 생리활성에 있어서 필연적으로 차이가 있으므로 글루타치온을 합성할 수 있는 능력에 차이가 있으므로 실험오차를 최소화하고 자료의 정확성을 확보하기 위하여 동일한 배합맥주효모가 동일한 인자 및 수준에서 사용되도록 노력하였다.실험오차를 최소화하고 자료의 정확성을 기하기 위하여 동일한 brewer& 묶음을 사용하여 최선을 다하고 있다#39;s 효모가 동일한 요인 및 수준에서 실험을 수행했습니다.

2.2 재료 및 시약

표 2.1 재료 및 시약

주요 기기 및 설비 2.3

표 2.2기기 및 장비

2.3기본 매체

흔들어 플라스크 중간체:25 g/L 포도당, 10 g/L 펩톤, 1.0 g/L K2HPO4, 1.0 g/L KH2PO4, 0.3 g/L CaCl2, 2. 5 g/L MgSO4, 0.05 g/L FeSO4.

미디엄 이전의 구성은 위와 같고, 미디엄 이후의 구성은 최적화 과정에서 약간의 조정이 있을 것입니다.

2.4 재배조건

일정량의 전 처리 brewer's 효모 슬러지를 원추형 플라스크에 첨가하고, 효모 슬러지 부피 대비 매질 부피의 20%의 비율에 따라 완전히 혼합하여 효모 슬러지를 용해시켰다.발효 시간은 24시간, 발효 온도는 28℃, 흔들 속도는 160 rpm, 액적의 부피 24 mL/300 mL로 시료는 3.0시간 간격으로 채취하여 세포 바이오매스, 총 글루타치온 및 세포 내 함량을 3개의 병행 세트 실험에서 결정하였다.

2. 5 측정방법

2. 5.1 Brewer's 효모 전처리

신선 맥주 효모 슬러리의 처리 전:무핑 양조장에서 나온 신선 맥주 효모 슬러리에서 탈이온수의 2배 부피를 넣고 저어가며 4~5회 헹구고, 효모 슬러리가 가라앉으면 초산과 부유물질을 버리고, 액체의 상층부가 무색하고 노란색에서 투명해질 때까지 반복해서 헹구고, 충분히 정적이 된 후 초산을 버리고 효모 슬러리를 4.0℃ 냉장고에 가져와 사용한다.

Brewer's glutathione 결정을 위한 효모세포 전처리:brewer&의 발효 국물 5.0 mL를 취한다#39;s 효모세포를 이용하여 원심분리관에 넣고 4500 rpm으로 원심분리하고 초산액을 버리고 40% 에탄올 용액을 넣고 40℃에서 2.0 h 동안 추출하고 5000 rpm으로 원심분리하고 초산액을 취하여 일정 횟수 희석하여 글루타치온 결정의 시료로 사용할 것이다.

2. 5.2 Brewer&의 세포 바이오매스 결정#39; s 효모

Brewer's 효모 유기체와 원심분리를 통해 얻어진 원심분리관을 80°C의 오븐에서 일정한 중량으로 건조시키고 정확한 무게를 측정하였으며, 총 brewer's 효모 유기체와 원심분리기 튜브의 무게는 (w1)로 측정되었다.그 다음 말린 brewer's 효모 유기체를 원심분리기 관 내에 세척하고, 원심분리기 관을 일정한 중량으로 건조시킨 후, 원심분리기 관의 무게를 (w0), 원심분리기 관의 총 무게를 (w0)로 하였다.w (g) = w1-w0다.

글루타치온의 측정방법 2. 5.3

테트록시딘법 (64):시험할 시료용액 1.0 mL를 취하여 20분간 완전히 반응시키기 위하여 0.1 mol/L 글라이콜산 0.5 mL, 0.24 mol/L 인산염 완충용액 3.5 mL, 1.0 g/L 테트록시딘 용액 1.0 mL를 첨가한 다음 305 nm의 자외선 분광광도계로 한305의 흡광도 값을 측정하였다.

2.6 실험방법

2.6.1 맥주 효모 발효 시간 결정

전 처리된 brewer's 효모 슬러지를 20% 부피로 중간체와 혼합하고 플라스크를 8% 부피로 흔합하였다.발효액을 28℃의 온도와 160 rpm의 회전속도로 30 h 동안 연속배양하였다.효모 발효 국물을 3시간마다 5.0 mL씩 섭취하여 효모의 총 글루타치온, 세포내 함량 및 세포 바이오매스를 측정하였다.세 그룹의 병렬 실험을 설정했습니다.

2.6.2주배양 조건과 영양소 조성의 효과

합성된 글루타치온에 대한 적재량의 효과 2.6.2.1

이 실험에서 쉐이크 플라스크 300 mL를 6%, 8%, 10%, 12%, 14%의 brewer&로 채웠다#39;s 효모 발효 국물을 내고 28 ℃의 온도와 160 rpm의 회전속도로 24시간 배양하였다.글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 및 brewer&의 바이오매스를 계산하여 최적 부하량을 결정하였다#39;s 효모 세포, 그리고 3개의 그룹이 병행 실험을 위해 설정되었다.

글루타치온의 합성에 미치는 온도의 효과 2.6.2.2

본 실험에서는 brewer&의 총 글루타치온, 세포 내 글루타치온 및 세포 바이오매스를 계산하여 최적 온도를 결정하였다#39;s 효모세포를 24℃, 26℃, 28℃, 30℃, 32℃에서 배양하고 실험 2.6.2.1에서 최적 적재량을 결정하였으며, 160 rpm의 회전속도로 24시간 동안 배양하였다.세 개의 병렬 실험을 설정했습니다.

합성된 글루타치온에 대한 포도당 농도의 효과 2.6.2.3

본 실험에서는 15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L 등 4가지 수준의 포도당 농도를 설정하고 이전 실험 2.6.2.1과 2.6.2.2에서 결정한 최적 적재량과 온도에서 160 rpm으로 24시간 배양하였다.brewer&의 총 글루타치온, 세포 내 글루타치온 함량 및 세포 바이오매스를 계산하여 최적 포도당 농도를 결정하였다#39; s 이스트.세 개의 병렬 실험을 설정했습니다.

합성된 글루타치온에 대한 펩톤 농도의 효과 2.6.2.4

15 g/L, 20 g/L, 25 g/L, 30 g/L, 35 g/L의 4단계의 펩톤 농도가 본 실험에서는 사용되었다.배양은 앞선 실험에서 결정된 최적 부하, 온도 및 포도당 농도로 160 rpm에서 24시간 동안 수행하였다.brewer&의 총 glutathione, 세포 내 glutathione 및 세포 바이오매스를 계산하여 적정 peptone 농도를 확인하였다#39; s 이스트.세 개의 병렬 그룹이 설정되었습니다.

2.6.2. 5 황산마그네슘 농도가 합성된 글루타치온에 미치는 영향

본 실험에서는 황산마그네슘을 각각 1.5 g/L, 2.0 g/L, 2. 5 g/L, 3.0 g/L, 3.5 g/L로 4단계 첨가하였다.앞선 실험에서 결정된 최적 적재량, 최적 온도, 최적 포도당 농도에서 160 rpm으로 24시간 동안 배양을 수행하였다.황산마그네슘의 최적 농도는 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 brewer&의 바이오매스를 계산하여 결정하였다#39;s 효모세포.세 개의 병렬 실험을 설정했습니다.

배양조건 최적화를 위한 반응표면 방법론 2.6.3

일원 실험 결과를 바탕으로 포도당 농도 (A), 황산마그네슘 농도 (B), 온도 (C)의 3가지 요인을 선정한 후 Box-Behnken에 의해 실험설계를 최적화하였으며, 실험의 요인과 수준은 표 2.3에 표시되어 있다.

표 2.3 실험 요인 및 수준

요인 기호 수준 1 수준 2 수준 3

전구체 아미노산 농도 및 첨가시간의 효과 2.6.4

본 실험에서는 brewer&의 생합성 과정에서 전구체 아미노산의 첨가 전략을 최적화하였다#39;s 효모세포에서 glycine (Gly), glutamic acid (Glu) 및 cysteine (Cys)의 농도와 3가지 전구체 아미노산의 첨가시간을 측정하였고, 최종적으로 합성된 glutathione의 총량으로 최적 첨가농도 및 시간을 결정하였다.3가지 전구체 아미노산의 초기 첨가 농도는 Gly의 경우 10 mmol/L, Glu의 경우 6 mmol/L, Cys의 경우 4 mmol/L 이었으며, 초기 첨가 시간은 brewer&의 경우 21시간이었다#39;s 효모 세포, 그리고 brewer&에 대한 24 h#39;s 효모세포.

글루타치온 합성에 미치는 Gly 농도의 효과 2.6.4.1

세 가지 전구체 아미노산을 함께 첨가하였고, Glu와 Cys의 초기 농도는 각각 6 mmol/L, 10 mmol/L로 변하지 않고 유지하였으며, Gly의 농도는 3.0 mmol/L, 6.0 mmol/L, 9.0 mmol/L, 12 mmol/L, 15 mmol/L로 변화하였다.Gly의 최적 농도는 총 글루타치온, 세포 내 글루타치온 함량 및 세포 바이오매스 지수를 계산하여 결정하였다.brewer&의 총 글루타치온, 세포 내 글루타치온 함량 및 세포 바이오매스#39;s 효모를 계산하여 Gly의 최적 농도를 결정하고 글루타치온 합성에 미치는 영향을 조사하였다.세 개의 병렬 실험을 설정했습니다.

글루타치온 합성에 대한 글루 농도의 효과 2.6.4.2

Glu의 최적 농도는 3.0 mmol/L, 6.0 mmol/L, 9.0 mmol/L, 12 mmol/L, 15 mmol/L로 설정하였으며, 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 brewer&의 바이오매스 지수를 계산하여 Glu의 최적 농도를 확인하였다#39;s 효모세포.글루타치온의 총량, 세포 내 글루타치온 함량 및 brewer&의 세포 바이오매스#39;s 효모를 계산하여 Glu의 최적 농도를 결정하고, 글루타치온 합성에 미치는 Glu의 영향을 조사하였다.세 그룹의 병렬 실험을 설정했습니다.

2.6.4.3 Cys 농도가 글루타치온 합성에 미치는 영향

상기 실험에서 Gly와 Glu의 최적 농도는 변하지 않은 상태로 유지하였으며, Cys의 농도는 2.0 mmol/L, 4.0 mmol/L, 6.0 mmol/L, 8.0 mmol/L로 변경하였다.glutathione의 총량과 세포내 glutathione 함량과 brewer&의 biomass index#39;s 효모세포를 계산하여 글루타치온 합성에 미치는 영향을 조사하기 위한 Cys의 최적 농도를 결정하였다.Cys의 최적 농도는 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 brewer&의 바이오매스 지수를 계산하여 결정하였다#39;s 효모세포에 Cys 가 글루타치온 합성에 미치는 영향을 조사하였다.3개의 병렬실험집단을 설정하였다.

전구체 아미노산 농도를 최적화하기 위한 반응표면 방법론 2.6.5

일원화 실험결과를 바탕으로 glycine 농도 (A), glutamic acid 농도 (B), cysteine 농도 (C) 등 3개의 요인을 선정한 후 Box-Behnken을 이용하여 실험설계를 최적화하였으며, 실험의 요인과 수준은 표 2.4에 표시되어 있다.

표 2.4 실험 요인과 수준

참고:글리신, 글루타민산, 시스테인 농도는 mmo/L이다.

전구체 아미노산 첨가 시기가 글루타치온 합성에 미치는 영향 2.6.6

3가지 전구체 아미노산의 최적 농도를 확인한 후, 전구체 아미노산의 첨가 시간이 brewer&에 의한 glutathione의 합성에 미치는 영향을 알아보았다#39;s 효모를 조사한 결과, 첨가시간은 각각 13 h, 16 h, 19 h, 21 h 및 24 h로 확인되었다.그 brewer's 효모세포를 24시간 배양하였으며, 전구체 아미노산의 최적 첨가시간은 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 brewer&의 바이오매스를 계산하여 결정하였다#39;s 효모세포.세 개의 병렬 실험을 설정했습니다.

2.6.7 Brewer&의 유통기한 결정#39; s 효모

이번 실험에서는 세포 성장의 변화와 brewer&에서 생성되는 글루타치온의 총량을 측정했습니다#39;s 효모 25 d 기간 동안 얻은 결과는 신선한 brewer&의 첫 날부터#39;s 효모 수집 25일까지.brewer&의 세포 바이오매스, 총 글루타치온 및 세포 내 글루타치온 함량#39;s 효모는 채취 첫날부터 fresh brewer& 배양 25일까지 매일 측정하였다#39;s 효모는 배양 전 4℃의 냉장고에 보관하였고, 배양 후 brewer's 효모가 전구체 아미노산의 첨가를 통해 24시간 동안 최적화되고, 세포 바이오매스, 총 글루타치온 및 brewer&의 세포 내 글루타치온 함량의 점증적 증가#39; 배양 전후의 s 효모를 계산하였다.총 글루타치온 및 세포 내 글루타치온 함량의 증감변화를 효모의 배양 전과 후에 계산하였다.

2.7 결과 및 분석

2.7.1 맥주 효모세포의 발효시간 결정

총 glutathione, 세포 내 glutathione 함량과 효모세포의 바이오매스를 측정한 결과 30 h brewer's 효모 세포 배양, 그 결과를도 2.1에 표시하였으며, 이로부터 brewer& 임을 알 수 있다#39;s 효모세포는 세포가 계속 성장하면서 0시간에서 13시간까지의 기간 동안 세포내 글루타치온을 합성하고 있었으며, 그 brewer's 효모세포는 기본적으로 성장을 멈추고 13시간부터 26시간까지 여전히 글루타치온을 합성하고 있었으며, 배양 30시간 후 총 글루타치온 함량을 측정하여 계산한 결과, 효모세포의 총 글루타치온 함량과 바이오매스를도 2.1에 나타내었다.13시에서 26시까지는 brewer&의 성장#39;s 효모 세포는 글루타치온이 합성되는 동안 기본적으로 멈췄다.연구에 따르면 [62]이 두 단계에서 전구체 아미노산을 첨가하면 글루타치온의 생성을 증가시킬 수 있다.맥주 생산 직후 양조장에서 나온 신선한 효모세포에서 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 효모세포의 바이오매스는 102.42 mg/L, 4.66 mg/g 및 21.46 g/L 이었다.실험 데이터로부터 글루타치온을 직접 추출할 경우 글루타치온 수율이 낮아 경제적 이익이 낮음을 알 수 있으므로 갓 수조에서 나온 신선한 효모를 표적재생산에 활용하여, 신선한 효모세포에서 글루타치온 생합성 효소시스템을 최대한 활용하여, 추후 글루타치온의 생합성에 적합한 영양 및 배양 조건을 제공하는 것으로 생각된다.그림 2.1에 나타낸 바와 같이 총 글루타치온, 세포내 글루타치온 및 효모세포 바이오매스는 배양 24시간 후 각각 26.82 g/L, 7.79 mg/g 및 208 mg/L의 최대치에 도달하였다.시간인자를 고려할 때 24시간의 최적발효시간을 결정하여 순수발효와 비교하여 많은 시간과 자원을 절약할 수 있었다.

그림 2.1 Brewer's 효모 성장과 glutathione 합성 곡선.

주요 배양조건 및 영양소의 효과 2.7.2

2.7.2.1 적재량이 글루타치온 합성에 미치는 영향

실험에 적재된 액체의 양은 주로 brewer&의 용존산소 수준으로 간주된다#39;s 효모 세포 배양액, 이는 brewer&의 성장에 영향을 미친다#39;s 효모 세포뿐만 아니라 세포 내 글루타치온의 합성도 어느 정도.

글루타치온 합성에 대한 적재량의 효과 2.2

액상 하중이 글루타치온 합성에 미치는 영향 2.2

그림 2.2를 보면 총 글루타치온의 양, 세포내 글루타치온 함량 및 효모세포의 바이오매스는 적재량이 증가함에 따라 증가하였다가 감소하는 것을 알 수 있다.가장 큰 이유는 적재량이 적었을 때 산소공급이 충분하고 brewer& 가 성장했기 때문일 것이다#39;s 효모는 왕성하였고, brewer&의 생체량의 증가를 보였다#39;s 효모세포는 총 glutathione의 양이 증가하였고, brewer&의 biomass#39;s 효모세포는 적재량 8%에서 최대치인 27.12 g/L에 달하였고, brewer&의 biomass#39;s 효모세포는 적재량의 증가에 따라 점차 감소되어 brewer&의 성장#39;s 효모세포는 적재량이 많을수록 억제되고, brewer&의 성장도 억제된다#39;s 효모세포는 더 큰 적재량에서 억제될 것이다.총글루타치온과 세포내 글루타치온은 8%에서 각각 212.07 mg/L, 7.82 mg/g으로 최대치에 도달하였다.

글루타치온 합성에 대한 온도의 효과 2.7.2.2

온도는 효모세포의 성장에 영향을 미치는 가장 중요한 요소 중 하나이다.온도는 글루타치온 합성효소의 활성에 영향을 미치고, 이는 다시 brewer&의 능력에 영향을 미친다#39;s 효모가 글루타치온을 합성하여 글루타치온 생성에 차이를 초래한다.온도가 효소활성에 미치는 영향은 일반적으로 온도가 너무 낮거나 너무 높으면 효소활성이 저하되고 최적온도에서만 효소활성이 극대화된다.

그림 2.3과 같이 효모세포의 바이오매스와 글루타치온 합성능력은 온도가 증가함에 따라 증가하였으며, 28℃에서 총 글루타치온, 세포내 글루타치온 및 효모세포 바이오매스의 최대값은 각각 216.51 mg/L, 7.85 mg/g 및 27.62 g/L로 도달하였다.

글루타치온 합성에 대한 온도의 영향 그림 2.3

글루타치온 합성에 대한 포도당 농도의 효과 2.7.2.3

포도당은 효모세포의 성장과 번식, 글루타치온의 생합성에 필수적이다.포도당은 효모세포에게 성장에 필요한 에너지를 제공할 수 있으며, 다른 한편으로는 글루타치온의 합성을 위한 ATP도 제공하여 결과적으로 글루타치온의 합성을 촉진시킨다.포도당의 적절한 농도는 brewer&의 성장을 촉진시킬 뿐만 아니라#39;s 효모 세포 그러나 글루타치온의 합성 효모 세포 때문에요.

글루타치온 합성에 대한 포도당 농도의 효과 2.4

포도당 농도가 글루타치온 합성에 미치는 영향 2.4

그림 2.4에서 보듯이 글루타치온의 생합성은 glucose 농도가 증가함에 따라 증가하였으며, 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 효모세포의 바이오매스는 각각 211.52 mg/L, 7.82 mg/g 및 27.82 g/L인 25 g/L glucose에서 최대치에 도달하였다.글루타치온, 세포내 글루타치온 및 효모세포 바이오매스의 총량은 각각 211.52 mg/L, 7.82 mg/g 및 27.82 g/L로 최대치에 도달하였다.

글루타치온 합성에 대한 펩톤 농도의 효과 2.7.2.4

질소원은 효모세포가 생장하는 중요한 조건의 하나이며 부동한 유기질소원은 효모내의 세포내물질의 생장과 합성에 일정한 영향을 준다.이번 실험은 주로 brewer&에 의한 glutathione의 합성에 대한 다양한 peptone 농도의 영향을 조사하였다#39; s 이스트.Fig. 2. 5에서 알 수 있듯이, peptone 농도가 glutathione의 총량에 미치는 영향은 크지 않으며, brewer&의 바이오매스에 미치는 영향은 크지 않다#39;s 효모세포도 유의하지 않다.전반적으로 펩톤 농도가 글루타치온 생성에 미치는 영향은 뚜렷하지 않으며, 비용 절감의 관점에서 볼 때, 연구의 후기 단계에서는 배양액에 펩톤을 첨가하지 않는 것으로 간주할 수 있다.

글루타치온 합성에 대한 펩톤 농도의 효과 2. 5

2.7.2.5 황산마그네슘 농도가 글루타치온 합성에 미치는 영향

마그네슘 이온은 글루타치온의 합성에 필수적인데, 글루타민-시스테인 합성효소 (글루타치온 1)와 글루타치온 합성효소 (글루타치온 2)의 활성을 증가시키고, 글루타치온 1의 피드백 억제를 감소시키며, 효소 활성을 향상시킬 수 있다 [54].따라서 배양 과정 중 적절한 황산마그네슘의 첨가는 글루타치온의 합성에 유익하고 글루타치온의 총 생산을 향상시킨다.

Fig. 2.6에서 MgSO4의 농도가 brewer&에 의한 glutathione의 합성에 비교적 큰 영향을 미친다는 결론을 내릴 수 있다#39;의 효모, 그리고 또한 brewer&의 성장에 큰 영향을 미친다#39;s 효모세포.MgSO4 농도가 증가함에 따라 glutathione과 cell biomass의 총량이 증가하였고, brewer&의 총량과 세포내 함량 및 cell biomass 가 증가하였다#39;s 효모세포는 MgSO4의 농도가 2.5 g/L 일 때 최대에 도달하여 212.88 mg/L, 7.81 mg/g, 27.25 g/L 이므로 MgSO4의 최적 농도는 2.5 g/L로 확인할 수 있다.212.88 mg/L, 7.81 mg/g, 27.25 g/L 이므로 MgSO4의 최적 농도는 2.5 g/L로 확인할 수 있다.MgSO4의 농도는 2.5 g/L 이었다.

MgSO4 농도가 글루타치온 합성에 미치는 영향 2.6

2.7.3배양조건 최적화를 위한 반응표면설계 실험

상기 일방향성 실험 결과를 바탕으로 brewer&에서 glutathione의 생합성을 위한 배양조건 최적화를 실시하였다#39;s 효모,의 결과

포도당 농도 (A), 황산마그네슘 농도 (B), 온도 (C) 가 글루타치온 총량 (Y)에 미치는 영향을 조사하기 위해 design Expert 10.0을 이용하여 반응표면설계 (RSD) 실험을 실시하였으며, 반응표면분석 (RSA)으로 분석하였다.

2.7.3.1 Box-Behnken 회귀분석

표 2.5 Box-Behnken 설계 및 결과

brewer&에서 glutathione 합성에 관한 3 요인 3 수준 반응표면설계 실험#39;s 효모를 Design Expert 10.0 소프트웨어를 이용하여 수행하였으며, 회귀분석을 통해 결과를 분석하였다.brewer&에 의해 생합성한 총 glutathione의 선택성 계수의 2차 다항회귀식#39; 포도당 (A), 황산 마그네슘 (B), 온도 (C)의 농도에 관한 s 효모를 다음과 같이 구하였다:Y= 194.56+ 5.04*A-5.61*B-7.53*C+ 0.14*AB-0.20*AC + 5.07*기원전 + 7.99*A-2 5.04*A-12.61*B-7.53*C+0.14 * AB-0.20. 07 * * AC + 기원전 +나 온 * A2-

37. 13*B2-46.98*C2 2.7.3.2분산분석 (ANOVA)

회귀식에 대한 분산분석 표 2.6

참고:R2 = 0.9969;R2Adj = 0.9930;" * "유의적인 차이를 나타낸다 (P<0.05);" * * "매우 유의한 차이를 나타낸다 (P<0.01).

표 2.6에서 볼 수 있듯이 모형의 F 값은 252.64, P 값은 <0.0001로 회귀모형의 차이가 매우 유의하였으며, R2=0.9969로 변량의 99.69% 가 모형에 의해 설명될 수 있음을 알 수 있었고, R2Adj=0.9930으로 회귀모형이 유의하였고, R2Adj와 R2Adj의 값이 비교적 서로 근접하여 회귀모형이보다 타당하였으며, 방정식이 잘 적합함을 알 수 있었다.R2와 R2adj 값이 서로 가깝다는 것은 회귀모형이 타당하며 식의 적합도가 높고 실험오차가 작다는 것을 의미하며, 모형을 이용하여 brewer&에서 glutathione 합성의 배양조건을 분석하고 예측할 수 있다는 것을 의미한다#39; s 이스트.부적합항의 p-값는 0.9820>0.01로 부적합항의 차이가 유의하지 않은, 즉, 모델에 부적합현상이 발생하지 않았고, 모델이 실험을 잘 설명할 수 있으며, 글루코오스, 황산마그네슘, 온도가 글루타치온의 생성에 미치는 영향을 분석하여 최적의 반응분자 수준을 얻는데 이용되었다.

모형에서는 AB, AC, BC를 제외한 모든 항목이 유의하며, 그 중 A 가 유의하고, B, C, A2, B2, C2가 매우 유의하여 포도당이 글루타치온 생성에 큰 영향을 미치고, 황산마그네슘과 온도가 글루타치온 생성에 큰 영향을 미치고, 3인자의 영향관계는 B (황산마그네슘) >C (온도) >(포도당)이다.

반응표면분석 2.7.3.3

모형식의 1차항과 2차항의 결과를 종합하면 포도당 (A), 황산마그네슘 (B) 및 온도 (C) 가 Brewer&에 의한 글루타치온의 합성에 미치는 영향이라는 결론을 내릴 수 있다#39;s 효모는 복잡하고, 단순한 선형 관계가 아니며, 반응 표면 효과가 유의하다.반응 표면도는 그림 2.7에 나와 있습니다.

brewer&에 의한 글루타치온 합성에 대한 요인 교호작용의 반응 표면도 그림 2.7#39; s 이스트

(a) 황산마그네슘-포도당 (b) 포도당-온도 (c) 온도-황산마그네슘

맥주 효모에 의한 글루타치온 합성에 대한 다양한 인자들의 상호작용을 나타낸 반응 표면도 2.7

그림 2.7부터, 상기 일방향성 실험의 결과는 영향을 미치는 인자의 수준이 증가함에 따라 글루타치온의 총량이 증가하다가 감소하는 반응표면설계 (RSD) 실험의 결과와 일치함을 알 수 있다.반응 표면 설계 실험은 다양한 요인의 교호작용이 실험 결과에 미치는 중요한 영향을 명확하게 반영할 수 있습니다.반응 표면의 기울기는 글루타치온 총량에 대한 인자 효과의 강도를 나타냅니다.

반응 표면 수준의 등고선이 타원에 가까울수록 두 요인 간의 교호작용이 실험 결과에 미치는 영향이 유의합니다.반응 표면의 등고선이 원에 가까우면 두 요인 간의 교호작용이 실험 결과에 덜 유의한 영향을 미칩니다.그림으로부터 전체 글루타치온의 양에 대해서는 유의하지 않았던 온도와 황산마그네슘의 상호작용을 제외하고는 요인들 간의 상호작용이 유의하였음을 알 수 있다.

회귀모델을 분석하여 brewer&에 의한 glutathione 합성의 최적조건을 도출하였다#39;s 효모는 glucose 농도 24.66 g/L, 황산마그네슘 농도 2.41 g/L, 온도 28.10 ℃ 이었으며, 이들 조건에서 glutathione의 총량은 195.64 mg/L 이었다.validation 실험에서 위의 조건을 반복한 결과, 실제 총 글루타치온량은 198.62 mg/L 이었다.반복실험에서 얻은 총 글루타치온 양과 예측값의 차이가 크지 않아이 모델이 brewer&의 배양 조건을 예측할 수 있음을 알 수 있었다#39;s 효모가 glutathione의 합성을 더 잘 하였고, 반응표면분석에서 얻어진 총 glutathione 양은 일원 최적화 실험에서 얻어진 것보다 조금 낮았는데, 이는 주로 반응표면분석 실험과 일원 최적화 실험이 서로 다르기 때문이다.반응표면분석 후 얻어진 글루타치온의 총량은 일원 최적화보다 조금 낮았는데, 이는 주로 반응표면분석 실험과 일원 최적화 실험을 각기 다른 brewer& 배치로 진행하였기 때문이다#39;s 효모이므로 2.2.1 실험재료에서 언급한 바와 같이 결과가 약간 달랐다.

전구체 아미노산 농도 및 첨가시간의 효과 2.7.4

brewer&에서 glutathione의 합성#39;s 효모세포는 반응의 중간물질로서 글루타치온의 합성에 전구체 아미노산이 관여하는 2단계 반응이 필요하므로 반응계의 경우 반응물의 농도가 생성물의 합성에 일정한 영향을 미치며 필요한 물질을 적정시기에 첨가하면 생성물의 합성에 일정한 영향을 미치게 된다,그래서 우리는 brewer&의 생합성 단계의 최적 시간에 전구체 아미노산을 첨가하고 농도와 첨가 시간을 최적화해야합니다#39; s 이스트.따라서 brewer&의 생합성 단계에서 최적의 시기에 전구체 아미노산을 첨가할 필요가 있다#39;s 효모, 그리고 전구체 아미노산의 농도와 첨가 시간을 최적화 한다.

합성된 글루타치온에 대한 Gly 농도의 효과 2.7.4.1

글루타치온 합성의 두 번째 단계의 반응물로서 Gly는 중간에서 합성 γ-glutamylcysteine, ATP와 Gly과 함께, 그리고에 의해 촉발시 글 루타 티 온 2.따라서 Gly의 농도는 글루타치온의 합성에 일정한 영향을 미친다.

합성된 글루타치온에 대한 Gly 농도의 효과 2.8

그림 2.8은 Gly 농도가 증가함에 따라 총 glutathione 및 세포 내 glutathione 함량과 세포 생체량이 증가함을 보여주는데, 이는 Gly 농도가 증가하면 brewer&의 생장뿐만 아니라 세포 생체량도 증가함을 나타낸다#39;s 효모 세포, 그러나 brewer&에 의해 glutathione의 합성을 촉진 합니다#39; s 이스트.Gly의 농도가 12 mmol/L 일 때 총 글루타치온 및 세포 내 함량은 최대치에 달하였고 농도가 증가함에 따라 총 글루타치온 및 세포 내 함량은 감소하기 시작하였고이 때 총 글루타치온은 302.54 mg/L, 세포 내 함량은 8.98 mg/g, 세포 생체량은 33.62 g/L 이었다.따라서 Gly의 최적 농도는 총 glutathione의 최대값이 나왔을 때 12 mmol/L 이었다.따라서 Gly의 최적 농도는 총 glutathione의 최대값에서 12 mmol/L 이었다.

글루타치온에 대한 글루루 농도의 효과 2.7.4.2

소 렌은 기본 반응의 합성을 위한 글 루타 티 온, 그리고 glutathione1 catalyzes γ의 합성-glutamylcysteine ATP의 에너지 공급 아래, 그래서 소 렌의 농도에 영향을 미치는 특정 한 글 루타 티 온의 합성이다.그림 2.9는 Glu 농도가 증가함에 따라 글루타치온의 총량이 점차 증가하였으며, Glu 농도가 6.0 mmol/L 일 때 각각 309.85 mg/L, 9.12 mg/g 및 33.86 g/L로 최대치에 도달하였고, Glu 농도가 증가함에 따라 총량과 세포내 함량은 감소하기 시작하였으나 세포내 바이오매스에 미치는 영향은 감소하기 시작하였다.Glu의 농도가 더욱 증가할수록 글루타치온의 총량과 글루타치온의 세포 내 함량은 감소하기 시작하였으나 세포 바이오매스에 미치는 전반적인 영향은 크지 않았다.따라서 글루타치온 합성을 위한 Glu의 최적 농도는 6.0 mmol/L로 확인되었다.글루타치온의 합성단계에서 Glu의 농도는 6.0 mmol/L 임을 확인하였다.

글루타치온에 대한 글루 농도의 효과 2.9

Glutathione에 대한 Cys 농도의 효과 2.7.4.3

Cys와 소 렌 모두의 초기 기판를 합성의 글 루타 티 온, 그리고 글 루타 티 온 중간의 합성 (γ-glutamylcysteine)은 ATP와에 의해 촉발시 글 루타 티 온 1, 그래서 Cys의 농도는 글 루타 티 온의 합성에 영향을 미 친다.

그림 2.glutathione에 대한 Cys 농도의 효과 10

그림 2.10과 같이 Cys 농도가 증가함에 따라 글루타치온 및 세포 바이오매스의 총량이 먼저 증가하다가 점차 감소하여 Cys 가 brewer&의 성장에 억제 효과가 있음을 알 수 있다#39;s 효모이며, Cys의 농도가 높을수록 brewer&의 생장에 대한 억제가 뚜렷하였다#39;s 효모세포.Cys의 농도가 4.0 mmol/L 일 때 total glutathione과 세포내 함량이 최대값에 도달하였고, total glutathione의 최대값은 310.42 mg/L로 대조군에 비해 51.33% 높았다.

2.7.5전구체 아미노산 농도를 최적화하기 위한 반응표면 방법론

상기 일방향성 실험 결과를 바탕으로 brewer&에서 glutathione의 합성에 관한 실험을 하였다#전구체 아미노산의 농도를 최적화하는 39;s 효모.

반응표면실험은 glycine 농도 (A), glutamate 농도 (B) 및 cysteine 농도 (C) 가 glutathione (Y)의 총량에 미치는 영향을 조사하기 위하여 Design Expert 10.0을 이용하여 반응표면분석을 실시하였으며, 실험의 결과는 표 2.7, 분산분석 (ANOVA)은 표 2.8에 나타내었다.

2.7.5.1 Box-Behnken 회귀분석

표 2.7 Box-Behnken 설계 및 결과

Design Expert 10.0 소프트웨어를 이용하여 brewer&에서 glutathione 합성조건에 대한 실험의 3 요인 3 수준 반응표면설계를 수행하였다#39;s 효모, 그리고 brewer&에서 생합성한 glutathione의 총량을 구하기 위해 회귀분석을 통해 결과를 분석하였다#39; s 이스트.

글리신 농도 (A), 글루탐산 농도 (B) 및 시스테인 (C)의 선택성 계수에 대한 2차 다항회귀식:Y=313.77+10.08*A+2.62*B-14.92*C+0.17 * AB + 0.018 * AC-0다.-23.88 기원전 15 * * A2-13.29 * B2-53.22 * C2

2.7.5.2분산분석 (ANOVA)

표 2.8에서 볼 수 있듯이 모형의 F 값은 275.81, P 값은 <0.0001로 회귀모형의 차이가 매우 유의함을 알 수 있었다.R2=0.9972로 변동의 99.72% 가 모형에 의해 설명될 수 있는 것으로 나타났으며, R2Adj=0.9960으로 모형의 유의성이 양호한 것으로 나타났으며, R2와 R2Adj의 값이 서로 비교적 근접하여 회귀모형이보다 타당한 것으로 나타났으며, 방정식 적합도 역시 양호한 것으로 나타났다.R2와 R2adj 값이 서로 근접하여 회귀모형이 타당하고 식의 적합도가 높으며 실험오차가 작음을 알 수 있었다.

회귀식에 대한 분산분석 표 2.8

참고:R2 = 0.9972;R2Adj = 0.9936;" * "유의적인 차이를 나타낸다 (P<0.05);" * * "매우 유의한 차이를 나타낸다 (P<0.01).

적합외 항의 p-값은 0.1092>0.01로 적합외 항의 차이가 유의하지 않은, 즉 모형에서 적합외 현상이 나타나지 않았으며 모형에서 실험을 잘 설명할 수 있음을 알 수 있었다.이 모델을 이용하여 글루타치온 생성에 미치는 glutamate, glutamate, cysteine의 효과를 분석하고 최적의 반응분자 수준을 알아내었다.모델에서는 AB, AC, BC를 제외한 모든 항목이 유의하였으며, 그 중 B 가 유의하였고, A, C, A2, B2, C2가 매우 유의하여 글루탐산 농도가 글루타치온 수율에 강한 영향을 미치고, 글리신과 시스테인 농도가 글루타치온 수율에 강한 영향을 미치고, 3인자간의 관계는 C (시스테인)>A (글리신)>B (글루탐산) 이었다.C (시스테인) >A (글리신) >B (글루타민산).

반응표면분석 2.7.5.3

모델 방정식의 1차항과 2차항의 결과를 조합하면, glycine 농도 (A), glutamic acid 농도 (B) 및 cysteine 농도 (C) 가 Brewer&에 의한 glutathione의 합성에 미치는 영향을 알 수 있다#39;s 효모는 단순한 선형관계가 아닌 복잡하며 반응표면효과가 유의하다.반응도는 그림 2.11에 나와 있습니다.

그림 2.brewer&에 의한 glutathione의 합성에 대한 전구체 아미노산의 반응표면도 11#39; 인자들의 교호작용에 의한 s 효모

(a) 글루타민-글리신 (b) 글리신-시스틴 (c) 시스틴-글루탐산

Figure.2다.글루타치온 합성을 위한 맥주효모와 전구체 아미노산의 상호작용에 대한 반응 표면도 11

그림 2.11에서 상기 일원 실험결과는 영향을 미치는 인자의 수준이 증가함에 따라 글루타치온의 총량이 증가하다가 감소하는 반응표면설계 (RSD) 실험의 결과와 일치함을 알 수 있다.반응 표면 설계 실험은 다양한 요인의 교호작용이 실험 결과에 미치는 중요한 영향을 명확하게 반영할 수 있습니다.반응 표면의 기울기는 각 요인이 글루타치온 총량에 미치는 효과의 강도를 나타냅니다.반응 표면의 수평면의 윤곽이 타원에 가까울수록 두 요인 간의 교호작용이 실험 결과에 미치는 영향이 더욱 크다.

반응 표면의 수평면의 윤곽이 원에 가까울수록 두 요인 간의 교호작용이 실험 결과에 미치는 영향은 유의하지 않습니다.그림에서 알 수 있듯이 총 glutathione에 대해서는 유의하지 않았던 glycine과 cysteine의 상호작용을 제외하고는 인자 간의 상호작용이 유의하였다.

회귀모델을 분석하여 brewer&에서 glutathione 합성의 최적조건을 도출하였다#39;s 효모는 glycine이 12.64 mmol/L, glutamate 가 6.30 mmol/L, cysteine이 3.72 mmol/L 이었고, 이들 조건에서 glutathione의 총량은 316.01 mg/L 이었다.validation 실험에서 위의 조건을 반복하였고, 실제 glutathione 양은 315.65 mg/L 이었다.반복실험을 통해 얻어진 글루타치온의 총량은 예측값과 크게 다르지 않았으며, 이는이 모델이 brewer&에서 글루타치온 합성을 위한 배양조건을 잘 예측할 수 있음을 보여주었다#39; s 이스트.

2.7.6전구체 아미노산 첨가 시간이 글루타치온에 미치는 영향

Brewer's 효모세포 성장은 두 단계로 나누어진다:제1단계는 효모세포 자체의 성장으로, 효모세포 자체가 성장하고 그 수가 증가하며, 효모 글루타치온을 소량 합성하는 단계;제2단계는 세포내 글루타치온의 합성단계로서 배양중의 포도당과 기타 영양소의 고갈로 세포자체가 수적으로 최고점에 도달한후 대량의 글루타치온 합성, 량빈 등을 포함한 세포함량의 합성이 이루어진다.두 번째 단계는 세포 내 글루타치온 합성 단계로 배양 성분 중 포도당과 다른 영양소의 고갈로 인해 세포 수가 정점을 이루고, 다량의 글루타치온 합성을 포함한 세포 내용물의 합성이 이어진다.배양 30시간 후 세포내 함량은 10.41 g/L로 대조구 대비 10.5% 높았으며, 글루타치온 생성량은 278 mg/L로 대조구 대비 116% 높았다.

관련 연구에 따르면 글루타치온 합성 단계에서 전구체 아미노산의 첨가는 글루타치온의 총량을 더 증가시킬 것이며, 따라서 brewer&에서 글루타치온의 합성에 따라#39;s 효모세포 이번 실험에서는 전구체 아미노산의 첨가시간을 brewer' 세포 배양 13, 16, 19, 및 24 h의 효모 세포를 s.

그림 2.혼합 전구체 아미노산의 첨가 시간이 글루타치온에 미치는 영향 12

Fig.2다.전구체 아미노산 첨가 시간이 글루타치온에 미치는 영향 12

그림 2.12에 나타낸 바와 같이 첨가시간이 증가함에 따라 glutathione 함량과 세포내 함량은 21시간에서 최대값에 도달하였고 세포 바이오매스 또한 최대값에 도달하였으나 전체적인 수준에서는 큰 차이가 없었으며 효모세포의 총 글루타치온, 세포내 글루타치온 함량 및 바이오매스는 24시간에서 유의적으로 감소하였다,최적화된 재배조건에서 효모세포에서 glutathione의 최대 생산량에 근접하였으나 전구체 아미노산의 첨가가 없었던 것.총 글루타치온 양, 세포 내 글루타치온 함량 및 효모세포 바이오매스는 24시간에 유의적으로 감소하였으며, 이는 전구체 아미노산의 첨가 없이 최적화된 배양 조건에서 효모세포에서 글루타치온의 최대 생산량에 근접하였다.그 이유는 24시간에 전구체 아미노산을 첨가한 것이 brewer&의 발효가 끝이었기 때문일 것이다#39;s 효모세포와 효모 세포는 전구체 아미노산으로부터 짧은 시간 내에 자신의 글루타치온을 합성할 수 없었다.첨가 시간이 21시간일 때 최대 glutathione 함량은 315.87 mg/L로 대조군에 비해 52.51% 높게 나타나 최적 첨가 시간을 21시간으로 판단하였으며, 그 결과 효모의 glutathione 생성이 대조군에 비해 높게 나타났다.

Brewer&의 세포 유지 시간 결정 2.7.7#39; s 효모

brewer&의 실험 조사 중#39;s 효모, fresh brewer& 후 저장시간이 연장될수록 동일한 조건에서 효모세포의 glutathione 합성능력이 감소하는 것으로 나타났다#39;s 효모를 회수하였으며, 효모의 글루타치온 합성능력은 저장시간의 연장에 따라 약화되었다.따라서 실험데이터의 안정성을 확보하기 위하여 brewer&의 저장시간을 측정하였다#39;s 효모세포를 측정하여 brewer&의 능력이 저하되기 전에 가능한 한 빨리 실험이 이루어지도록 하였다#39;s 효모 세포가 글루타치온을 합성하여 실험 결과의 정확성을 정확하게 파악한다.

그림 2.brewer&에서 세포 바이오매스와 증가적 글루타치온 생산의 변화 13#39;s 효모는 25 d 이상 최적화 전후.

Fig. 2.13부터 저장시간이 증가함에 따라 최적화된 배양 brewer&의 바이오매스 증진율을 알 수 있다#39;s 효모세포가 점차 감소하여 brewer&의 성장을 나타내었다#39; 저장시간이 긴 s 효모세포는 최적화 후 크게 증가하지 않았으며, 이는 주로 brewer&의 활성에 기인하는 것으로 보인다#39;s 효모세포가 많이 손실되었고, 글루타치온의 총량의 증가가 작아 이후 분리 실험 작업에 도움이 되지 않았다.

brewer&의 생리활성#39;s 효모는 저장시간이 증가함에 따라 감소하였으며, 저온에서 저장시간이 증가함에 따라 생장 및 glutathione 생산능력이 감소하였다.저장시간이 5 d보다 길면 글루타치온의 총량, 세포내 글루타치온 함량 및 효모세포 바이오매스의 증가율이 각각 5%, 7% 및 9% 감소하였으므로, 생물학적으로 합성된 glutathione in brewer&의 수율을 높이기 위해서는 신선한 효모를 수조에서 떨어뜨린 후 최초 5 d 이내로 배양하는 것이 좋다#39; s 이스트.따라서 신선한 brewer&를 복용한 후 처음 5d 이내에 글루타치온 생산을 위해 효모를 배양하는 것이 좋습니다#39;s 효모는 brewer&에 의한 glutathione 생합성의 수율을 증가시키기 위하여 탱크 밖으로 나왔다#39; s 이스트.

3. 요약

이번 실험에서는 brewer's 효모세포를 균주로하고, brewer&의 능력을 높이기 위해 배양조건 및 전구체 아미노산 첨가 전략을 조사하였다#39;s 효모는 스스로 글루타치온을 합성한다.다음과 같은 결론을 얻었다:

(1) 배양조건의 일방향성 최적화를 통하여 최종적으로 배양액의 주성분은 포도당과 MgSO4로 각각 22 g/L~28 g/L, 2.0 g/L~3.0 g/L의 농도와 26℃~28℃의 외부조건인 액적 부피가 8%인 것을 확인하였다.반응표면설계법을 바탕으로 포도당 농도, 황산마그네슘 농도, 온도의 3가지 주요 인자를 더욱 최적화하여 최적 공정 조건인 포도당 농도 24.66 g/L, 황산마그네슘 농도 2.41 g/L, 온도 28.10 ℃를 얻었다.이러한 조건에서 총 glutathione의 양은 198.62 mg/L로 초기 glutathione의 양보다 93.93% 높았다.brewer&의 최적 배양 시간#39;s 효모세포는 24 h로 brewer&의 생장변화를 측정하여 확인하였다#39; s 이스트.

(2) glycine, glutamic acid 및 cysteine의 일방향 최적화를 통해 3가지 전구체 아미노산이 Gly의 경우 9.0 mmol/L 내지 15 mmol/L, Glu의 경우 3.0 mmol/L 내지 9.0 mmol/L, Cys의 경우 2.0 mmol/L 내지 6.0 mmol/L의 농도로 첨가되는 것을 최종 확인하였고, 이를 바탕으로 반응표면설계법을 이용하여 3가지 주요 요소인 Gly 농도, Glu 농도, Cys 농도를 더욱 최적화하여 최적의 공정조건을 얻었다.이를 바탕으로 3가지 주요 인자인 Gly 농도, Glu 농도 및 Cys 농도를 반응표면설계를 이용하여 더욱 최적화하여 최적 공정조건을 구하였다:glycine 농도 12.64 mmol/L, glutamic acid 농도 6.30 mmol/L, cysteine 농도 3.72 mmol/L, 이들 조건에서 얻어진 글루타치온의 총량은 315.65 mg/L 이었다.최적 공정 조건과 비교하여 최적 공정 조건에서 얻어진 글루타치온의 총량은 315.65 mg/L 이었다.glutathione의 총량은 최적조건에 비하여 58.92%, 초기량에 비하여 208.19% 증가하였다.전구체 아미노산의 첨가시간을 최적화하여 brewer& 배양 후 첨가시간이 21시간임을 확인하였다#39; s 이스트.

(3) 마지막으로 brewer&의 보존시간#39;s 효모세포가 조사되었다.25일 후, 연구는 brewer&의 글루타치온 생성, 세포 내 함량 및 세포 바이오매스를 보였다#39;s 효모는 보존시간의 연장에 따라 감소하였으며, brewer&의 glutathione 생성, 세포 내 함량 및 세포 생체량의 증가율#39;s 효모는 전구체 아미노산 첨가에 따라 감소하였으므로 fresh brewer& 후 5일 이내에 실험을 수행하여야 한다#39;s 효모를 탱크에서 꺼내 생산량을 늘렸다.따라서 신선한 brewer& 후 5 d 이내에 실험을 수행해야 합니다#수율을 높이고 실험 데이터의 안정성을 확보하기 위하여 39;s 효모를 탱크 밖으로 꺼냈다.