Steviol Glycoside Rebaudioside A 란?

매일 먹는 식단에서 많은 당분 섭취는 비만을 유발하는 요인 중 하나다.고혈압, 고혈당, 당뇨병 등 비만으로 인한 심혈관 질환은 전 세계적으로 인류의 건강에 영향을 미치는 중대한 공중보건 위기이다 [1].스테비오사이드는 제로 칼로리 감미료이다스테비아 식물의 잎에서 추출되며,"world& 중 하나로 알려져 있습니다#39; s사탕수수 설탕, 사탕무 설탕 [2]과 함께 3대 설탕 원천.스테비아 식물의 잎에 있는 스테비오사이드는 구조가 다른 분자들의 혼합물로, 주로 스테비오사이드 (St), 리보디오사이드 한(Reb a), 리보디오사이드 D (Reb D), 리보디오사이드 M (Reb M)[3] 등이 있다.Reb A), 리보디오사이드 D (Reb D), 리보디오사이드 M (Reb M) 등 [3].스테비오사이드의 단맛은 수크로스의 250~350배이며, 제로칼로리 천연 당원 [4]의 신세대로서 수크로스를 대체할 수 있다.

1990년대 이후 유럽과 미국의 많은 국가의 식품 의약품 규제 기관에서는 스테비오사이드의 안전성을 평가하고 고순도 (≥95%)를 만장일치로 승인했습니다안전한 감미료로서의 stevioside[5].최근 일부 임상 실험 결과 스테비오사이드는 감미료 [6]로 사용될 뿐만 아니라 항당뇨, 혈압 저하, 심장기능, 항염증, 항균, 항종양 등등 [7] 다양한 건강 효능이 있음이 밝혀졌다.

이런 건강 증진 특성 덕분에 스테비오사이드는 더 넓은 시장 수요를 갖게 됐다.연구원들은 현재 개발 다양 한 새를 추출하는 방법과 합성 stevioside, 승진을 크게의 생산과 응용 프로그램 stevioside [8 ⁃10].본 논문은 스테비오사이드의 안전성과 시장 수요를 개괄하고 식품 및 건강 제품 분야에서 스테비오사이드의 응용 분야를 요약하고에 대한 전망을 제공합니다stevioside의 식물 추출과 생합성, 스테비오사이드의 심층적인 연구와 산업적 생산을 위한 이론적 토대를 마련.

1. stevioside의 안전 및 시장 수요

1980년대 후반, 그stevioside의 안전광범위한 의문을 받았고, 그래서 각국은 스테비오사이드의 안전성에 대한 연구를 시작했다.1995년 미국 식품의약국 (FDA)은 스테비아를 건강보조제 [5]에 사용할 수 있도록 승인했다.2013년과 2014, 2008년, Reb 한 Reb D와 Reb, M은 연속적으로 인정 받는만큼 일반적으로 인정 받고 안전 한 식품 의약 국에 의해 (그 라스) [11 ⁃ 12].그 후, FAO/WHO 합동 식품첨가물 전문가위원회 (JECFA) [13], 식품표준인 호주 뉴질랜드 (FSANZ) [14], 유럽식품안전청 (EFSA) [15], 인도식품안전표준청 (FSSAI) [16] 에서도 스테비올 글리코사이드의 안전성을 연이어 인정받았다.FSANZ) [14], 유럽식품안전청 (EFSA) [15], 인도식품안전표준청 (FSSAI) [16] 등이 있다.2011년 중국 관련 부처는 스테비오사이드를 음료, 보존과일, 조미료, 패스트리 및 기타 식품 [3]에 식품 첨가물로 사용하는 것을 공식적으로 승인했다.

중국은 세계's 스테비아 글리코사이드의 최대 생산자다.중국 스테비아 협회에 따르면 2009년 China's 스테비아 재배 면적은 약 16,667 헥타르로 주로 신장, 간쑤, 내몽골, 허베이, 장쑤, 안후이, 헤이룽장 및 기타 지역에 분포되어 있으며 연간 스테비아 원료 생산량은 약 4만 톤이었다 [17].Steviaglycosides생산은 27개 이상의 성과 시에서 완전히 촉진되었습니다.중국에서 생산된 스테비오사이드의 약 80%는 일본, 한국, 미국, 말레이시아 등 20여 개국에 수출된다.중국은 현재 세계 's 스테비오사이드 [18]의 최대 수출국이다.같은 국가 및 지역 게다가, 러시아, 인도, 캐나다, 남아프리카 공화국,, 케냐도 승진에 대한 다양 한 재배 지역의 경작 [19 ⁃ 21]다.

현재 스테비오사이드는 월드 & 가 되었다#39;s 가장 널리 사용되는 0 칼로리 천연 고강도 감미료.Stevioside는 에너지 균형을 향상시킬 수 있습니다그리고 체중 조절에 도움을 줍니다.국제 스테비오사이드 협회의 통계에 따르면, 2016년 세계적으로 스테비오사이드를 함유한 약 3,000개의 식음료 제품이 출시되었고, 소비자 수는 40억 명을 넘어섰다 [22].2017년 스테비오사이드를 감미료 첨가제로 사용한 식품 수가 아스파탐을 감미료로 사용한 식품 수를 초과했다.제품, 그리고 그것을 소비하는 사람들의 수가 40억 명 [22]을 넘어섰다.2017년에는 스테비아 글리코사이드를 감미료로 사용한 식품 수가 아스파탐을 감미료로 사용한 제품 수를 앞질렀다 [23].2027년까지 스테비오사이드 분말의 전 세계 소비량은 연간 7%에서 8%의 성장율로 10,254.93톤에 달할 것으로 추정된다 [24].

Reb A는 시장에서 가장 널리 사용되는 스테비오사이드입니다다.2015년 1월부터 2017년 2월까지 고순도 Reb A (≥95%)의 가격은 73,000 USD/톤에서 77,300 USD/톤으로 상승했다 [23].2017년 세계 시장 규모는 4억 1700만 달러에 달했다.기술의 발전과 새로운 세대의 천연 감미료 Reb M의 개발로 2024년까지 스테비아의 시장 매출은 7억 2100만 달러로 연간 8.2% 성장할 것으로 예상된다 [25].관련 시장 연구 보고서에 따르면, 글로벌 스테비오사이드 시장은 2020년 6억 2080만 달러 규모였으며, 2028년에는 연복합성장률 (CAGR) 8.0%로 11억 1400만 달러에 이를 것으로 예상된다.10억 달러 [24], 2030년에는 164억 2800만 달러 [26]의 시장 규모로 연평균 성장률이 8.5%에 달할 수 있다.

2 스테비올 글리코 사이드 응용 프로그램

감미료로서의 스테비올 글리코사이드 2.1

스테비올 글리코사이드는 식품에 사용할 수 있습니다다른 감미료와 조합해서 사용해도 여전히 좋은 맛을 유지하기 때문에 [27] 식품 첨가물로서 다른 비율로.스테비올 글리코사이드의 안전성이 인정되면서 스테비올 글리코사이드는 시장에서 널리 사용되고 있다.스테비올 글리코사이드의 일반적인 형태는 분말, 정제, 액체로, 음료, 맥주, 베이커리 제품, 델리카트젠, 보존식품, 가공 과일 및 야채, 조미료, 냉동 식품, 소스, 과자 및 시리얼 [6] 등의 식품에 천연 감미료로 사용될 수 있다.

2013년 코카콜라는 스테비아가 함유된 음료를 생산하기 시작하면서 칼로리를 30% [28] 줄였다.2018년 코카콜라는 스테비아 글리코사이드로 백설탕을 완전히 대체한 스테비아 콜라를 출시하면서 백설탕이 가져다주는 달콤하고 느끼한 느낌을 바꾸고 달콤하고 맛있는 단맛으로 대체했다.단맛에 대한 욕구를 충족시키면서 낮은 당도 [29]를 달성한다.Stevioside는 기판의 점도를 줄일 수 있습니다일부 응용 시나리오에서는 과일주의 점도를 좀 더 맛있게 바꾸고, 맥주의 거품을 강하게 만들어 거품이 짙고 오래 지속되게 하는 등 [30].

이구운 음식에 자당 대신 스테비올 글리코사이드 사용반죽의 발효 속도와 빵의 부피를 감소시키고, 혈당 지수와 에너지 함량을 감소시킴으로써 빵의 영양적 가치를 향상시킬 수 있다 [31].sucrose를 대체하기 위해 다양한 비율로 stevi한추출물로 제조한 귀리 비스킷의 외관, 맛, 냄새 및 질감과 같은 감각적 특성을 평가하였다.그 결과 25%와 50%의 자당을 스테비아 추출물로 대체하여 제조한 비스킷이 소비자들에게 가장 인기가 있었다 [27].

젤리와 잼을 제조할 때, 설탕의 첨가는 최종 단맛에 영향을 미칠 뿐만 아니라, 총 가용성 고형분 [32]을 증가시키는 데도 도움을 준다.젤리나 잼에 들어있는 설탕은 물이나 하이드로겔과 함께 젤리를 만든다.스테비올 글리코사이드가 수크로스를 완전히 대체하기 위해 사용되면 젤리가 제대로 굳지 않고 외관에 영향을 미친다.때 톨,스테비오사이드 (stevioside)와 아가르 (agar) 가 함께 사용된다, 젤리가 원하는 대로 굳고 젤리와 잼의 칼로리를 줄일 수 있습니다 [33~34].

스테비아 글리코사이드는 무설탕의 수크로스를 대체하는데 사용될 수 있다참과, 용과, 파파야, 구아바, 키위 등으로 만든 사탕과 호두, 땅콩, 잣 등의 견과류.미네랄 영양을 제공하면서도 소비자들을 만족시킨다#39;달콤함에 대한 욕망 [35].초콜릿의 자크로스를 스테비올 글리코사이드로 대체하면 원본과 비슷한 맛의 무설탕 초콜릿이 만들어질 뿐만 아니라 people&을 만족시킨다#39;s 맛에 대한 요구, 그러나 또한 가능한 체중 증가와 당 대사 질환의 위험을 감소시킨다 [36].또한 steviolglycoside는 미생물에 의해 이용되지 않는다.절임이나 절인 채소에서 수크로스를 스테비올 글리코사이드로 대체하면 미생물의 증식을 조절하고 발효 중 부패를 방지할 수 있다 [37].

스테비올 글리코사이드의 건강 증진 기능 2.2

스테비오사이드는 감미료 역할만 하는 것이 아니다, 그러나 항당뇨, 항심장섬유증, 항지방간, 항염증, 항균, 항종양 특성 [7] 등 다양한 생물학적 활동과 건강상 이점도 있다.서로 다른 스테비오사이드의 최종 대사산물이 모두 스테비올이기 때문에 스테비올은 체내에 축적되지 않아 스테비오사이드는 독성 부작용을 일으키지 않고 [38] 건강식품으로 사용해도 무방하다.

Steviol glycosides스테비올, Steviol glucoside, stevioside, rebaudioside A, stachydrine과 Reb A는 streptozotoc에서유발 제2 형 당뇨병 마우스에 공급하기 위해 사용되었다.스테비오사이드 유도제를 먹인 제2 형 당뇨병 생쥐와 비교하여, 스테비오사이드 유도제를 먹인 제2 형 당뇨병 생쥐는 인슐린 분비가 유의하게 증가하였고, 간에서 포도당 대사가 강화되었으며, 간 글리코겐이 촉진되었고, 혈당 농도와 당화헤모글로빈 (HbA1c) 수치가 감소되었으며, 생쥐에서 당뇨병이 개선되었다 [39].

지방간 쥐에게 75~150 mg/kg St를 6주간 먹인 결과, 쥐의 실험군에서 지방간의 정도가 유의적으로 감소되어 St 가 혈중 지질을 낮출 수 있음을 알 수 있었다 [40].St는 sodium dextran sulfate에 의해 유발된 궤양성 대장염을 가진 쥐, lipopolysaccharide (LPS)에 의해 치사성 쇼크를 유발한 쥐, Freund&에 의해 유발된 보조성 관절염을 가진 쥐에게 공급하였다#39;s 완전보조제 (FCA).St 가 친염증 인자의 분비를 억제하고, 항염증 사이토카인의 생성을 향상시키고, 염증 반응을 현저히 감소시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다 [41].(Freund' s 완료 보조, FCA) 유도 보조 관절염 쥐, 그것은 세인트 proinflammatory 요인의 석방을 억제 할 수 있 다는 것을 발견, 항 염증 cytokines,의 생산을 향상 시키고 염증 반응을 현저하게 줄 일 [41 ⁃ 43]다.

Stevioside는 항 심장 섬유증에 명백한 효능이 있습니다, 항균 및 항 종양.생쥐에서 isoproterenol-induced myocardial fibrosis를 st로 40일간 경구 처리한 후, mice's 심근 hydroxyproline 수치와 심장 무게 지수가 감소하였고, 심근 섬유증의 정도가 유의하게 감소되었다 [44].20 mg/mL st는 대장균의 성장을 억제할 수 있습니다.st의 농도를 조절하면 Bacillus subtilis, Aspergillus niger, Rhizopus oryzae 등의 성장을 억제하여 억제효과를 볼 수 있다 [45].Reb A는 미셀로 자체 조립할 수 있습니다.Reb A와 honokiol을 공식화 (홍콩)으로 self-assembled 정자 Reb ⁃ 한 홍콩 구강 홍콩의을 개선 할 수 있 것 이며 antitumor 활동을 강화 한다따라서 스테비오사이드는 소수성 항암제 [46]의 전달에 큰 잠재력을 가지고 있다.스테비올 글리코사이드는 또한 히드록시기 및 superoxide 라디칼과 같은 반응성 산소 종을 제거할 수 있으며, 고혈압, 제2 형 당뇨병, 동맥경화증 및 종양과 같은 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.

스테비올 글리코사이드의 준비 방법 3

3. 스테비올 글리코사이드 식물 추출 1

에 대한 전통적인 방법스테비올 글리코사이드를 추출하고 있습니다식물에서 추출 뜨 거 운 물을 포함, 용매 추출, maceration, 그리고 흡착에 macroporous 송진 [47 ⁃ 50].이러한 방법은 시간과 노력이 많이들 뿐만 아니라 상대적으로 비효율적이며, 과도한 용매와 에너지를 소모한다 [51].현대 생명공학의 발달로 연구자들은 천연 스테비아에서 스테비올 글리코사이드를 추출하는 다양한 방법을 개발했다.

마이크로파 보조 추출 (Microwave-assisted extract, MAE)은 마이크로파 에너지를 이용하여 용매로의 스테비오사이드 전달을 촉진할 수 있다.이 방법은 기존의 마테리얼 기법과 비교하여 최적 작동 온도가 낮고 최적 추출 시간이 마테리얼 방법의 1/7로 단축된다 [49].초임계 유체 추출 (SFE)은 전통적인 마트레이더 기술보다 효율적일 뿐만 아니라 이산화탄소 배출량과 용매 소비량을 감소시킨다 [52].

초음파 ⁃ 조력 추출 (UAE) 주로 석방은 초음파 진동을 이용 하여 파열 세포와 세포 내 물질이들어 있습니다.다른 추출 기술과 비교했을 때이 방법은 추출 온도가 더 온화하다 [53].rapid solid-liquid dynamic extract (RSLDE)를 사용하여 추출한 Reb A와 St는 무색의 투명한 액체이며, 전통적인 마테리얼 방법을 사용하여 추출한 제품은 진한 노란색입니다.RSLDE 방법은 스테비오사이드의 생성을 증가시킬뿐만 아니라 후속 제품 정제 단계를 감소시켜 결과적으로stevioside의 생산 비용을 절감합니다[54].상기 추출 방법은 아직 실험실 연구 단계에 있으며 [49, 53] 산업 적용 비용을 줄이기 위해 추가 연구가 필요하다.

steviol과 rebaudioside A의 함량을 in스테비아 잎이 가장 많은데 잎의 건조중량의 5% 내지 10%와 2% 내지 4%를 차지한다각각 [55].따라서 기존의 추출기술로 얻어진 제품의 주성분은 steviol과 rebaudioside A. Reb D와 Reb이다 M은 극히 낮은 수준으로 스테비아 잎에 존재하며, 잎의 건조중량의 0.4~0.5% 만을 차지하므로 스테비아에서 Reb D와 Reb M을 직접 추출하는 것은 비효율적이고 비용이 많이 든다 [9, 56].

3. 스테비오사이드의 생합성 2

식물에서 스테비오사이드를 직접 추출할 경우 스테비오사이드의 함량과 식물 생장주기에 영향을 받는 경우가 많다.최근 연구자들은 게놈 염기서열 분석 등의 기술을 사용하고 서열 태그 (ESTs)를 표현하여 천연 스테비아 (stevia)에서 스테비오사이드의 주요 합성 경로를 밝혀,의 이종 생성에 대한 토대를 마련했다 [10, 57]합성생물학을 이용한 steviosides.여러 종류의 스테비올 글리코사이드의 주요 차이는 설탕 그룹의 수와 위치에 있으며, 이로 인해 단맛과 식감이 달라진다는 연구 결과가 있다 [58].삼당류 St와 사당류 Reb A는 자당류보다 250~300배 단맛이 나며, 뒷맛이 약간 난다 [59];오당류인 Reb D와 육당류인 Reb M은 자당류보다 350배 달며, 뒷맛이 거의 없고 맛이 더 좋다 [9].

주요Reb D와 Reb M의 합성 경로에서 stevia은 다음과 같다:steviol은 glycosyl에 의해 촉발시 transferases SrUGT85C2고 포도당 그룹의 설탕을 전송 할 SrUGT74G1 기증자 uridinediphosphate 포도당 (UDP-glucose)을 통해 steviol 해골의 C13-hydroxyl 그룹를 β-D-glucoside 채권이다.포도당 (uridinediphosphate 포도당, UDPG)를 steviol의 C13-hydroxyl 및 C19-carboxyl 기능 그룹을 통해 해골을 β-D-glucoside 본드를 형성 하기 위해 rubusoside (문지르) [60];rubusoside 양식의 C13-glycosyl 그룹 1, 2-β-D-glycosidic 본드의 촉매작용 아래 glycosyl transferase SrUGT91D2 세인트 [61]를 형성 하기 위해;St 양식의 C13-glucosyl 그룹 1, 3-β-D-glycosidic 본드의 촉매작용 아래 glycosyl transferase SrUGT76G1 catalyzes의 형성 1, 3-β-D-glycosidic 본드를 생성하는 Reb [56]이다;Reb A의 C19위치의 글루코실 그룹은 SrUGT91D2와 SrUGT76G1에 의해 연속적으로 촉매되어 Reb D와 Reb M을 생성한다 (그림 1) [61].

이stevioside의 biotransformation현재 스테비오사이드의 산업 생산을 달성하는 가장 비용 효율적인 방법입니다.스테비오사이드의 생물학적 변형은 주로 다음과 같다:(1) 포도당을 탄소원으로 사용하여 스테비오사이드를 이형적으로 합성하기 위해 glycosyltransferase 유전자를 과발현 시킴으로써 미생물의 스테비오사이드 합성 경로를 구축;(2) biocatalysis를 이용하여 stevioside를 합성한다.

3. 2. 1 stevioside의 de novo 합성

건설 mevalonic 산 (영국 측) 생산 경로에서 대장균, 소개 한 후 terpene 유전자를이들어 있는 모 듈을 geranyl diphosphate synthase, cyclopentapropanoyl diphosphate synthase과 kaurene synthase, 한 cytochrome P450 유전자를이들어 있는 모 듈을 diaglycolate oxidase, kaurene 13α-hydroxylase과 cytochrome P450 reductase,과 13 α-hydroxylase과 cytochrome P450 reductase, 뿐만 아니라 glycosyltransferase으로 구성 된 모 듈의 glycosyltransferases SrUGT85C2,Sr UGT91D2w, SrUGT74G1 및 SrUGT76G1, 얻어진 균주 SSY10 pSY447은 5일 이내에 처음부터 10.03 mg/L의 Reb A를 합성할 수 있다 [61].

의 합성 경로스테비올은 Reb MSaccharomyces cerevisiae에서 성공적으로 제조되었다 (그림 1). 돌연변이 UGT76G1 Leu257Gly는 UGT76G1보다 4배의 Reb D를, 돌연변이 UGT76G1 Lys337Pro와 UGT76G1Thr55Lys는 모두 UGT76G1보다 약 4배의 Reb M을 생산하였다.UGT76G1의 4배였다.돌연변이 UGT76G1 Lys337Pro와 UGT76G1Thr55Lys는 Reb M을 20% 정도 생산하는 능력이 강화되었고, Reb G, Reb Q 등의 부산물 생산이 거의 없어졌다 [9].

전통적인 식물 추출 및 화학 합성 방법과 비교하여, 인위적으로 설계된 de novo 합성스테비올 글리코사이드는 특정한 스테비올 글리코사이드를 생성 할 수 있습니다더 짧은 시간 및 환경 친화적인 방식으로 예상 경로에서.그러나 미생물에 의한 스테비올 글리코사이드의 de novo 합성은 많은 촉매 반응 단계를 수반하기 때문에 일부 주요 단계에 대한 미생물 내 효소의 발현 수준이 낮고, 활성이 좋지 않아 일반적으로 스테비올 글리코사이드의 수율이 낮다.

3. 2. 스테비오사이드의 생체촉매 합성 2

Biocatalytic스테비오사이드의 합성은 효소를 이용하는 과정을 말한다또는 효소를 생산하는 미생물을 스테비오사이드 합성의 촉매로 한다.스테비아 UGT76G1은 St[9] 로부터 Reb A의 생산을 촉매할 수 있다.glycosyltransferase UGT76G1은 앵커 단백질인 Gcw61p를 이용하여 Pichia pastoris GS115의 표면에 발현된다.재조합 균주는 St를 기질로, UDPG를 글리코실 공여체로, 전세포 촉매작용을 이용하여 Reb a를 생성하며, 전환율은 약 70.37%이다 [62].UDPG는 비용이 많이 드는데, 촉매 작용 비용을 줄이기 위해 연구자들은 Arabidopsis sucrose synthase AtSUS1과 수수 U GT76G1을 E. coli에서 공동 발현시켰다.AtSUS1의 crude enzyme solution은 sucrose와 uridine diphosphate (UDP) 가 UDPG로 전환되는 것을 촉매하였고, 재조합 효소인 SrUGT76G1은 St를 기질로 사용하여 Reb A의 합성을 촉매하였다 [58].이 방법은 현장에서 UDPG를 합성하기 위해 저렴한 UDP와 sucrose를 기질로 사용하여 스테비오사이드 (stevioside)의 산업 생산 비용을 더욱 절감시킨다 (그림 2) [11, 58].

SteviarebaudianaUGT91D2 할 수 있습니다Reb A 로부터 Reb D의 생산을 촉매한다[10].그러나 재조합 효소인 SrUGT91D2에 대한 연구는 현재 전무한 실정이다.연구자들은 토마토 글리코실 트랜스퍼라제 UGTSL2를 대장균에서 발현시켰고, 재조합 효소는 Reb A 로부터 Reb D와 Reb M2의 생성을 기질로 촉매할 수 있었다 [63].Reb M2는 Reb M의 이성질체로, 안전성은 검증되지 않았다 [16].

UGTSL2의 포화 돌연변이가 더 진행되면 돌연변이 Asn358Phe 가 생성되어 촉매 활성이 21.9% 증가하였으나 [64] 생성물에는 소량의 Reb M2가 여전히 존재하였다.9% 이지만 소량의 Reb M2는 여전히 상품에 존재하였다 [64].그 glycosyltransferase EUGT11 쌀 (Oryza sativa)에서 대장균에 표명 되었고 Pichia pastoris XE ⁃ 재조 합 변종 3를 얻고 BL21 (pET28a~Ⅳ OsEUGT 11)다.XE 표명 한 재조 합 효소 EUGT11 ⁃ 3에서 가장 높은 활동을 가지고 킨 듯프로듀서 Reb DpH 6.0-6.5의 인산 나트륨 완충기에서 45 °C에서 UDPG를 당 공여체로 한다.BL21 (pET28a-OsEUGT11)이 발현하는 재조합 효소 EUGT11은 pH 8.5의 Tris HCl buffer에서 35 °C에서 가장 높은 촉매 활성을 보인다 [65].

Pichia pastoris에서 발현된 재조합 EUGT11은 대장균 (Escherichiacoli)에서 발현된 재조합 효소보다 높은 내산성과 열안정성을 갖는다 [65].직교 설계를 사용하여 개발된 2단계 온도 제어 전략이 사용됩니다Reb D의 생산을 최적화합니다XE ⁃ 3 변종에 있다.XE ⁃ 3에서 재조 합 변종은 재배 되 BMMY 0.75% 메탄올이 함유 된 중간 및 pH 5 BMMY 중간~(메탄올 ⁃ 복잡 한 중간 버퍼 링)에서 28 ° C 3-4 d를 얻 으려면 대상의 단백질 약 790 mg/L OsEUGT11이다.결과적으로, 그리고 UDPG 기증 설탕을이 Reb 가 박테리아에 추가 되었문화, 그리고의 전체적인 세포 XE ⁃ 3 재조 합을 촉발시 킨 변종의 구체적인 생산 Reb D Reb에서 35 ° C 4 D,과 93.47%의 수율이다.

이 방법은 단백질 분리 및 정제 단계를 단순화한다 (도 3) [65].보다 높은 활성을 갖는 새로운 glycosyltransferases를 발견하기 위해 연구자들은 상동성 서열 비교, 영역 분석 및 3차 구조 시뮬레이션 등 생물정보학적 방법을 결합하여 Capsicum annuum에서 glycosyltransferases CaUGT와 Solanum tuberosum에서 StUGT를 선별하였다.이들은 대장균 (Escherichia coli)에서 발현되었으며, 재조합 효소인 CaUGT와 StUGT는 모두 Reb a를 Reb D로 전환하는 촉매를 위해 UDPG를 당 공여체로 사용할 수 있으나, 재조합 효소 CaUGT의 촉매 생성물은 부산물인 Reb M2를 포함하는 반면, 재조합 효소 StUGT는 구체적으로 Reb a를 Reb D로 전환하는 촉매를 97%의 수율 [66]로 할 수 있다.

SrUGT76G1 이외에 Reb D의 Reb M. 전환을 촉매하는 글리코실트랜스퍼라제는 발견되지 않았다. Recombinant SrUGT76G1은 Escherichia coli에서 발현된다Reb D를 Reb M으로 변환하여 72.2%의 전환율을 보였다[67]다.돌연변이 SrUGT76G1T284S는 Reb D를 Reb M으로 변환하는 속도를 약 50% 증가시켰다 [68].대장균에서 발현되는 SrUGT76G1은 포함체를 형성하기 쉬워 [65] 글리코실 트랜스퍼레이스의 효율적인 생산에 영향을 미친다.연구진은 SrUGT76G1의 c-말단부에 짧은 산성 펩타이드 태그를 융합시켜 4개의 산-꼬리 융합 효소를 얻었으며, 이를 통해 대장균에서 SrUGT76G1의 가용성 발현 수준, 열안정성 및 촉매 활성을 향상시켰다.산성 c-말단 융합효소는 pH 9.0 [69]의 수산화당-나트륨 완충에서 Reb D와 UDPG를 기질로 사용하여 Reb M의 생산을 촉매할 때 야생형의 활성이 202.46%로 나타났다.

저렴한 기판으로부터 고부가가치의 스테비오사이드를 직접 생산하는 촉매작용을하고, 반응시간을 단축시키며, 생산비용을 절감하기 위하여, 연구자들은 다중 효소 캐스케이드 시스템을 개발하였다.OsEUGT11, SrUGT76G1, Arabidopsis sucrose synthase AtSUS3가 공동 발현되면 재조합 세균은 할 수 있다직접 Reb A 로부터 Reb M의 생산을 촉매한다, UDP, 기판으로 sucrose [68].재조합 박테리아에서 SrUGT76G1을 암호화하는 유전자를 284위치의 트레오닌이 세린으로 변이되도록 변이시키면 전세포 촉매 생성물인 Reb M과 Reb D의 비율이 1:3.9에서 7:1로 증가하고, 중간 생성물인 Reb D의 비율이 감소하며, Reb M의 수율이 증가한다 [68].효소 고정화 기술은 효소의 재사용성을 높이고 효소 반응 비용을 줄일 수 있다.

글루타알데히드를 교반제로, 키토산을 운반체로 사용한 결과, 대장균에서 발현된 OsEUGT11과 SrUGT76G1은 키토산 미구에 각각 공유결합되어 재조합 효소의 저장 안정성과 재사용성을 향상시킬 수 있었다.다만 Reb M의 생산은 고가의 Reb D 기판 때문에 한계가 있다.직접저렴한 Reb A에서 Reb M을 생성합니다연구진은 한 단계로 OsEUGT11과 SrUGT76G1을 키토산에 동시에 고정시켜 계단식 반응을 구축했다.얻어진 공동고정화 효소는 UDPG를 당 공여체로 사용한다.3 mmol/L MgCl2가 첨가된 pH 7.0의 인산나트륨 완충제에서는 Reb a를 직접 촉매하여 개별고정화의 혼합계보다 3.2배 더 활성인 Reb M을 생성할 수 있다 (그림 4). 인산나트륨 완충제3 mmol/L MgCl2가 첨가된 Reb a는 효소촉매에 의해 직접 Reb M으로 전환될 수 있으며, 활성이 혼합계만의 경우보다 3.2배 높아 Reb M의 생산비용을 성공적으로 절감할 수 있다 (그림 4).

요약하면, 바이오촉매 기술은 조작이 간단하고 촉매 특이성이 높으며 부산물을 거의 생성하지 않아 이후 생성물의 분리 및 정제가 용이하여 스테비올 글리코사이드의 산업적 생산이 용이하다 [70].

4 요약 및 전망

의 새로운 유형으로서입니다제로 칼로리 천연 감미료, 스테비오사이드의 식품이자 약효입니다또한 지속적으로 연구되고 있다.2018년에는 더욱 달콤한 맛의 Reb D와 Reb M이 광범위한 주목을 받았으며 Reb A를 대신해 새로운 세대의 천연 감미료로 각광받을 것으로 기대된다.그러나 스테비아에 함유되어 있는 Reb D와 Reb M의 함량은 극히 낮고, 식물에서 추출하고 정화하는 데 드는 비용이 높아 응용과 개발에 한계가 있다.

stevioside의 생합성은 Reb D와 Reb M.의 효율적인 생산을 촉진하는 중요한 방법이며, 향후 stevioside의 생합성 효율은 다음과 같은 방법으로 향상 될 수 있다:(1) 기존 글리코실 트랜스피레이스의 수와 활성은 제한적이다.생물정보학은 새로운 유형의 매우 고효율 글리코실 트랜스퍼라제를 발견하고, 재조합 효소의 발현 수준, 촉매 효율 및 열적 안정성을 향상시키기 위해 분자 개량 기술을 사용할 수 있습니다;(2) 합성생물학 기술을 이용하여 대장균과 같은 미생물 세포에서 포도당으로부터 Reb D와 Reb M을 합성하는 경로를 구축하고, 관련 대사망 조절, 유전자 조절요소 개발 및 최적화 등을 통해 Reb D와 Reb M의 수율을 향상시켜 이를 증가시킨다R e b D 및 R e b M의 수율;(3) 고정화, 전세포촉매, 다효소계통과 조효소재생기술을 개발하여 생산원가를 절감함으로써 스테비오사이드의 시장응용을 가속화한다.

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