Haematococcus Pluvialis Astaxanthin 검사방법 4

Astaxanthin, chemically named 3,3'-dihydroxy-beta, beta'-carotene-4, 4'-디오네, 케토카로티노이드에 속한다다.연구에 따르면 아스타잔틴은 가장 강력한 천연 항산화 물질이라고 합니다 [1-2].아스타잔틴은 항산화, 항방사선, 항노화, 항종양, 심혈관 질환 예방 및 치료 기능 [2-3]을 가지고 있으므로 경제적 가치가 극히 높다.보건품, 의약품, 사료첨가제, 화장품, 기능식품, 식품첨가물, 기타 영역 [4]에 사용되고 있다.

아스타잔틴 생산의 주요 원료는 새우와게 껍질 [3, 5], 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcuspluvialis) [4]와 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis) [6]에서 나온다.그 중 Haematococcuspluvialis는 스트레스 조건에서 건조 중량의 5%까지 astaxanthin을 축적할 수 있다.아스타잔틴의 구조는 2개의 키랄 C 원자를 포함하고 있기 때문에, 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 에서의 구조는 3S, 3S&이다#39;, 그리고 합성 형태는 키랄 혼합물, 주로 3R, 3R'.헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)는 천연 아스타잔틴 생성의 가장 좋은 원천으로 여겨진다.

Haematococcus pluvialis는 스트레스를 받은 후 젤리 같은 조개 같은 외벽을 형성한다.세포 내 색소를 추출할 때 기존의 용매로는 세포 내부로 들어가기 어려워 색소를 추출할 수 없었다.보통 셀 벽 깨기 방법을 병행할 필요가 있다.둘째, Haematococcus pluvialis 세포의 astaxanthin은 주로 astaxanthinester의 형태로 존재하는데, 즉, 아실 사슬이 다른 astaxanth에서monoester 분자와 astaxanthindiester 분자가 있다.HPLC 분석은 모든 분자의 기준분리가 어렵고, 함량을 계산할 때 분자량이 다르다.

또한 astaxanthin은 불안정하여 빛이나 열과 같은 조건에서 분해되기 쉬우므로 astaxanthin의 정확한 판별에는 일정한 문제가 있다.본 논문은 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin의 추출, 가수분해 및 검출에 관한 최근의 연구 현황을 살펴보고, 다양한 목적에 맞는 Haematococcus pluvialis의 astaxanthin함량을 신속하게 결정할 수 있는 적절한 방법의 선택에 관한 지침을 제공하는 것을 목적으로 한다.

헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)에서 아스타잔틴 추출 1

astaxanthin의 추출은 그 함량을 정확하게 판별하기 위한 기초이며 또한 astaxanth에서측정의 불확실한 측면 중 하나이다.스트레스 상태에서 헤마토코쿠스 플러비알리스 세포는 아스타잔틴을 축적하지만, 세포의 성장과 분열이 멈추어 움직일 수 없는 포자, 즉 젤리 모양의 세포를 형성한다.성숙한 젤리성 세포는 3 층 두께의 단단한 세포벽을 가지며, 가장 바깥층은 아세트산 가수분해에 강한 저항성을 갖는 물질인 알가난 (algaenan)이다.두 번째와 세 번째 층은 각각 만노스와 셀룰로오스가 균일하고 균일하지 않게 분포되어 있다 [7].

젤리 같은 세포벽을 가진 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 경우 기존의 분해 및 추출 방법으로는 세포 내부로 접근하여 색소를 추출할 수 없다.

At present, in 이industry, supercritical CO2 추출technology [7], high pressure/ultra-high pressure homogenizat이온extraction technology [8], 그리고부정적인pressure cavitation method [9] are used to 추출 astaxanthin에서Haematococcus pluvialis. The above 방법can effectively 추출astaxanthin, but they require a large amount 의algal powder 그리고are complicated to operate, so they are suitable 을large-scale industrial production. The extraction methods used to detect Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin include solvent extraction, mechanical grinding + solvent extraction, dimethyl sulfoxide (DMSO) extraction, 그리고cellulase wall breaking + solvent extraction.

1.1 용매 추출법

용매 추출법은 조작이 쉽고 비용이 저렴하며 장비 요구량이 적다.추출 용매, 액체 대 용매 비율, 추출 온도, 추출 시간만 최적화하면 된다.일반적으로 사용되는 용매로는 아세톤 [10], 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 에탄올 등이 있다.그러나 헤마토코쿠스 플러그알리스 (Haematococcus pluvialis)의 젤리 같은 껍질 외벽 때문에 기존의 용매는 세포 내로 들어갈 수 없으며, 아스타잔틴의 추출률은 낮다.Mendes-Pinto 등은 Haematococcus pluvialis 로부터 astaxanthin의 추출용매로 아세톤을 사용하였으며, 추출율은 4 mg ·g-1 (알조가루 1g 당 추출된 astaxanthin mass)에 불과하였으나, 기계적 분쇄 + 아세톤 추출은 19 mg ·g-1로 용매가 세포내로 들어가 astaxanthin을 추출할 수 없음을 알 수 있었다 [10].

Ruen-ngam compared solvent extraction methods assisted by ultrasound (Ultrasound Assisted Extraction), microwave (Microwave Assisted Extraction), 그리고Soxhlet (Soxhlet Extraction). The extraction rate astaxanthin의reached 74% 사용microwave assisted extraction at 75 °C for 5 min [11]. In addition, to enhance 이extraction efficiency 의the solvent, chemical cell wall 중단involves treating Haematococcus pluvialis cells with acids or alkalis. Sarada et al. reported that treating the cells with 2 mol·L-1 hydrochloric acid solution at 70 °C for 2 min, followed by extraction with a solvent, can achieve an astaxanthin 추출 rate 의86%–94% [12]. However, it is worth noting that placing astaxanthin in a high concentration of acid or alkali solution can easily cause degradation of astaxanthin. The above results show that due to the special cell wall composition of Haematococcus pluvialis, direct solvent extraction cannot enter the cells, while auxiliary ultrasound, microwave and acid-base treatments are all prone to cause degradation astaxanthin의and are not suitable for astaxanthin extraction.

1.2기계 세포벽 파괴 + 용매 추출

기계적 세포벽 파괴 (Mechanical cell wall disruption)는 실험실에서 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 외부의 힘을 이용하여 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 세포벽을 파괴하는 방법이다.Haematococcus pluvialis GB/T 31520-2015 [13]에서 astaxanthin의 검출을 위한 국가표준에서 Haematococcus pluvialis는 유리 균질기를 사용하여 철저히 갈은 후, 그 색소는 dichloromethane-methanol을 용매로 사용하여 추출한다.기계적 파쇄 + 용매 추출법은 아스타잔틴 (astaxanthin)의 검출에 더 일반적으로 사용된다 [10, 14-16].기계적인 분쇄는 세포벽을 손상시킬 수 있으며, 색소는 완전히 추출될 수 있습니다.이 방법은 조작이 간단하지만,이 방법은 각 시료를 세포 균질기를 통해 갈아야 하므로 시간이 많이 걸리고 고생이 많다.

1.3 셀룰라아제 벽 파괴 + 용매 추출

Since the cell wall of Haematococcus pluvialis is mainly composed of substances such as cellulose, pectin and lipopolysaccharides, cellulase, pectinase and polysaccharidase are used to break the cell wall of Haematococcus pluvialis [8]. Zhou Jinke et al. explored a new enzymatic method for extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis [17]. Cellulase: enzymatic hydrolysis of algal powder, ethanol extraction. The optimal process conditions for enzymatic extraction are: initial pH of the enzymatic solution 4.5, enzymatic hydrolysis temperature 45 °C, enzyme dosage 1.5%, and enzymatic hydrolysis time 15 h. Under these conditions, the astaxanthin extraction rate was 94.6%, which is 61.5% higher than the traditional direct ethanol extraction method. It has the advantages of low operating temperature, less pollution, low cost, and high extraction rate. It is easy to achieve 녹색industrial production, but this method is time-consuming, and high temperatures can also cause degradation of astaxanthin.

1.4 DMSO 추출법

DMSO는 다양한 용매와의 miscibility와 cell에 대한 투과성이 좋다.약물이나 살충제의 침투강화제, 세포의 냉동보존시 보호제로 많이 쓰인다.실리는 DMSO를 이용해 미녹조 엽록소와 카로티노이드를 추출할 수 있다고 처음 보고했다 [18]..Boussiba 등은 DMSO를 이용하여 Haematococcus pluvialis 로부터 색소를 추출하였다.추출은 70 °C 수조에서 10분간 수행하였으며, 70 °C 수조에서 2~3회 추출을 반복함으로써 알류 잔류물을 무색으로 만들 수 있으며 [19], DMSO는 투과성이 우수하고 아스타잔틴을 완전히 추출하기 위해 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 세포로 침투할 수 있음을 보여준다.DMSO 추출은 Haematococcus pluvialis의 세포벽을 처리할 필요가 없어 astaxanthin 추출 과정을 크게 단순화시키며, astaxanthin 검출에 사용되고 있다 [20-21].또한, 월드 &#Cyanotech, 일본의 Fuji, China& 등 대표적인 미세조류 기업 39개사#39;s Green A 생명공학 회사 [8]는 모두 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)에서 아스타잔틴을 추출하는 DMSO 방법을 아스타잔틴 검출에 적용했다.

DMSO를 부종제로 사용하면 세포벽의 투과도를 높일 수 있으며, Haematococcus pluvialis의 검출에 필요한 세포벽 파괴 과정을 간소화하여 Haematococcus pluvialis 로부터 astaxanthin의 추출제로 사용할 수 있다.

아스타잔틴 에스터의 가수분해 2

Haematococcus pluvialis에 축적된 astaxanthin은 all-trans 3S, 3S 'configuration, with one hydroxyl group in each endocyclic structure. It is usually esterified with C16, C18 or C20 fatty acids to form astaxanthin 에스테르 to stabilize its structure [22]. Most of them are astaxanthin monoesters, accounting for about 75%, astaxanthin di에스테르accounting for about 20%, and free astaxanthin only accounting for 5% [12, 23]. There are as many as 30 different types of astaxanthin monoesters and diesters in Haematococcus pluvialis [24]. The complexity of astaxanthin esters makes purification and direct and accurate 물량problematic. Therefore, the extracted astaxanthin esters need to be hydrolyzed into free astaxanthin to achieve purification of a single substance and accurate quantification by HPLC. There are generally two methods for hydrolyzing astaxanthin esters: saponification and enzymatic hydrolysis.

2. 1 Saponification

Saponification은 일반적으로 NaOH 또는 KOH 메탄올 용액에서 수행되어 아스타잔틴 에스테르를 자유 아스타잔틴으로 가수분해한다.Yuan 등은 saponification 중 높은 알칼리 농도나 반응 온도는 astaxanthin ester의 가수분해에 도움이 되지만, astaxanthin의 분해를 가속화하기도 한다 [14].또한 Chen Xingcai 등은 free astaxanthin의 농도가 알칼리 농도가 증가함에 따라 선형적으로 감소하는 것을 보여주었다 [25].Yuan 등은 ester saponification에 따른 astaxanthin의 가수분해 운동성과 알칼리 농도에 따른 astaxanthin의 분해를 연구하였다.그 결과 NaOH 농도가 0.0175~0.020 mol · L-1인 22 °C 반응계에서 아스타잔틴 에스테르가 완전히 가수분해되어 아스타잔틴 분해가 일어나지 않았다.그러나 나오-메탄올 용액의 농도가 높아지거나 반응온도가 높아지면 [26] 아스타잔틴이 크게 분해되었다.아스타잔틴 에스테르를 위한 석화 방법의 조건은 가혹하다.알칼리 용액의 농도, 석출과정 중의 석출온도 및 시간은 모두 석출의 효율과 아스타잔틴의 안정성에 영향을 미치며, 이는 아스타잔틴의 정확한 판정에 영향을 미치는 또 다른 측면이다.

2.2 효소 가수분해 방법

Zhao reported that a water-soluble alkaline esterase from Penicilium cyclopium can convert astaxanthin esters into astaxanthin. The reaction conditions were incubation at 28 °C with stirring for 7 h, and the 복구of astaxanthin reached 63.2% [27]. However, this enzyme has low hydrolysis efficiency and has not been widely used in the determination of astaxanthin content. Jacobs first reported that the lipid-soluble cholesterol esterase can rapidly hydrolyze carotenoid esters [28]. Although there are currently few reports in the literature on this enzymatic method, it is used by domestic and foreign companies producing astaxanthin as a gentle method of hydrolysis. The cholesterol esterase used not only completely hydrolyzes the astaxanthin ester, but also does not easily cause oxidation of astaxanthin, which can more accurately determine the astaxanthin content.

astaxanthin을 함유한 Haematococcus pluvialis 추출물에 콜레스테롤 esterase를 단기간 사용하면 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin의 검출 효율이 크게 향상됩니다.

Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin의 정량 검출 3

아스타잔틴을 검출하는 주요 방법은 분광광도법, 가수분해효소 (hydrolysis-HPLC), HPLC-MS 등이 있다.

3. 1 Spectrophotometry

Boussiba reported that chlorophyll in Haematococcus pluvialis was destroyed by heating with 5% KOH-30% methanol solution for about 10 minutes, and then the astaxanthin was extracted with DMSO. The absorbance was measured at a wavelength of 475 nm to calculate the astaxanthin concentration. This method can quickly estimate the astaxanthin content and is widely used in cultivation and production [12, 29]. However, some reports have shown that the treatment of the alkali solution to destroy the chlorophyll in this method causes 25% to 40% degradation of astaxanthin [16].

따라서 Li 등은 Boussiba&를 개선하였다#39;s 방법은 알칼리 처리없이 DMSO에서 직접 추출하고, 530 nm의 가시광선 파장에서 검출하여 다른 카로티노이드 및 엽록소의 간섭을 피한다.이 방법은 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) [16]의 아스타잔틴 함량의 신속한 검출을 위해 사용되었다.Geng Jinfeng's 연구결과 재배과정 중 Haematococcus pluvialis의 carotenoids와 astaxanthin의 함량은 안정적인 선형관계에 있는 것으로 나타났다.직접적이고 쉽게 carotenoids를 측정하여 간접적으로 astaxanthin의 함량을 구하는 방법을 이용하면 carotenoids의 함량을 빠르게 확인할 수 있으며, 얻어진 carotenoids와 astaxanthin의 상관관계를 바탕으로 Haematococcus pluvialis의 astaxanthin 함량을 빠르게 계산할 수 있다.본 실험실의 데이터도 분광광도법으로 측정된 카로티노이드 함량과 효소가수분해물-hplc로 측정된 astaxanthin 함량 사이에 좋은 선형 관계가 있음을 보여준다 (그림 1). 따라서 DMSO 추출법은 475 nm에서 분광광도법을 이용하여 astaxanthin 함량을 직접 확인할 수 있으며 그림 1의 관계를 확인할 수 있다.

3.2가수분해-hplc 법

After the Haematococcus pluvialis pigment is pretreated by saponification or enzymatic hydrolysis, HPLC can be used to accurately determine the free astaxanthin. At present, the national standard for astaxanthin determination GB/T 31520-2015 uses the method of HPLC after saponification for determination [13]. The separation column is a reverse-phase C30 column, and the detection of all-trans-free astaxanthin, 9-cis- astaxanthin, and 13-cis-astaxanthin can be detected in 20 min. Yuan used a C18 column to analyze astaxanthin esterified with saponin. Methanol/dichloromethane/acetonitrile/water was used as the mobile phase for gradient elution, and a single sample was detected in 16 min [30]. Cyanotech's, Haematococcus pluvialis의 함량을 확인하는 방법은 색소를 추출한 후 가수분해하여 HPLC 결정을 하는 것이다.이 가수분해에 의한 전처리는 astaxanthin ester를 astaxanthin으로 전환시켜 astaxanthin 화합물이 포함된 혼합성분을 하나의 astaxanthin 성분의 검출로 전환시켜 HPLC 분석이보다 간단하여 정확한 정량이 가능하며, 높은 반복성을 갖는다.이상의 아스타잔틴 역상 크로마토그래피 분리 조건을 하기 표 1에 요약하였다.

3.3 HPLC-MS 방식

astaxanthin과 그 에스테르 유도체를 추출하는 다양성과 복잡성으로 인해, 전통적인 분광 광도법 및 HPLC 방법은 다른 astaxanthin 에스테르 분자 사이의 차이를 식별할 수 없습니다.질량분석기는 아스타잔틴 에스터 분자 간의 질량과 조각 정보의 차이를 이용하여 다른 분자들을 더 잘 구분할 수 있으며, 이후 정성 및 정량 분석을 수행할 수 있다.추출된 색소 시료를 처리 없이 HPLC/MS로 직접 측정하는 방법은 saponification 과정에서 astaxanthin의 분해를 피할 수 있으며, astaxanthin, astaxanthin 에스테르, 기타 carotenoids 및 엽록소를 동시에 측정할 수 있다.

그것은 아스타잔틴 조성 결정과 아스타잔틴 대사 기전 연구에 특정 응용이 있다.Holtin 등은 LC-(APCI)MS를 이용하여 자유 아스타잔틴 이성질체, 아스타잔틴 모노에스터, 아스타잔틴 디에스터, 그리고 Haematococcus pluvialis [24]의 루테인을 정성적으로 분석하였다.Weesepoel 등은 ESI-IT와 MADIL-TOF/TOF를 이용하여 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin ester acyl chain의 결정 및 cis와 트랜스 이성질체의 구분 등 [32]보다 상세한 astaxanthin ester의 분석을 수행하였다.아스타잔틴 및 이의 에스테르 유도체의보다 많은 크로마토그래피 분리 결과를 하기 표 1에 요약하였다.카로티노이드 및 아스타잔틴 에스테르류의 낮은 극성이 일반적으로 사용되는 연이온화 ESI 이온 소스를 사용하여 이온화하는 것을 어렵게 한다는 점에 주목할 필요가 있다.APCI 이온 원료는 astaxanthin esters의 분석에 더 일반적으로 사용됩니다.

본 논문은의 추출, 가수분해 및 검출을 위한 현재의 방법들을 검토하고 평가한다astaxanthin in Haematococcus pluvialis다.아스타잔틴 함량은 DMSO로 추출한 후 475 nm 파장에서 분광광도법으로 직접 측정한다.아스타잔틴 함량은 분광광도법으로 측정된 카로티노이드 함량과 HPLC로 측정된 아스타잔틴 함량의 선형 관계를 바탕으로 빠르게 계산된다.이 방법은 연구 중 중요한 매개변수를 빠르게 얻는 데 더 도움이 된다.DMSO 추출 후, 가수분해를 위해 콜레스테롤 esterase를 사용하고, 아스타잔틴의 함량을 정확하게 결정하는 방법으로 사용될 수 있는 자유 아스타잔틴의 함량을 확인하기 위해 HPLC를 사용한다.다른 검출 목적을 위해, 다른 방법을 분석에 사용할 수 있으며, 다른 실험실 또는 방법 간의 데이터 비교는 추출 된 시료의 가수분해 처리 및 HPLC 분석 후 결과에 교정해야합니다.

참조:

[1]Kobayashi M,Sakamoto Y. Singlet oxygen quenching ability of astaxanthin esters from the green 녹조의Haematococcus pluvialis[J].생명공학 편지, 1999년, 21일 (4):265-269다.

[2] 브 Y M a. 항 산화 활동 of astaxanthin  and  관련 카로 티 노이 드다 [J다]저널 농업의 and  음식 화학, 2000년, 48 (4):1150-1154.

[3]Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L,Goycoolea F M. Astaxanthin:A review of its chemistry and applications (J).식품과학과 영양학의 비판적 고찰 (Critical Reviews in Food Science and Nutrition),2006,46(2):185-196.

[4]Cuellar-Bermudez S P,Aguilar-Hernandez I,Cardenas-Chavez D L, 외 고부가대사산물의 추출 및 정제

미세조류로부터:필수지질,astaxanthin 및 phycobiliproteins[J].2015년 미생 물의 생명공학, 8 (2):190-209다.

[5]Lin W C,Chien J T,Chen B h. 액체chromatography[J]에 의한 창새우 껍질 (Parapenaeopsis hardwickii)의 Carotenoids 결정.한국농식품화학학회지,2005,53(13):5144-5149.

[6] Ni Hui, 홍청린, Xiao Anfeng 외.Pichia pastoris [J]의 고수율 균주 astaxanthin의 생산성능 (Production performance of a high-yield strain of astaxanthin from Pichia pastoris [J])중국생명공학저널 2011, 27(7):1065-1075.

[7] 김 D-Y, Vijayan D, Praveenkumar R, et 알다. Cell-wall disruption  및 지질/astaxanthin 미세조류로부터 추출:클로렐라와 헤마토코쿠스 (J.구라 기술, 2016년, 199:300-310다.

[8] 유소레이, 두웨이춘, 야오챠오 등.Haematococcus pluvialis의 벽파괴 처리를 위한 물리적 방법과 결합된 효소가수분해에 관한 공정 연구 (J.식품공학, 2016 (4):38-40.

[9] Zu Yuangang, Liu Lina, Xue Yanhua 외.음압cavitation 법에 의한 astaxanthin의 추출 [J.동북산림대학교 논문집 2007, 35(2):59-60.

[10]Mendes-Pinto M M,Raposo M F J,Bowen Jet al. Evaluation of different cell disruption processes on encysted cells of Haematococcus pluvialis:effects on astaxanthin recovery and implications for bio-availability[J].한국응용식물학회지 2001,13(1):19-24.

[11] Ruen-ngam D, Shotipruk A, Pavasant p. 비교 of  extraction  methods  for  recovery  of  astaxanthin  Haematococcus pluvialis[J] 로부터.분리과학과 기술,2011,46(1):64-70.

[12]Sarada R,Vidhyavathi R,Usha D, 외. green alga Haematococcus pluvialis[J]에서 astaxanthin의 추출을 위한 효율적인 방법.한국농식품화학학회지,2006,54(20):7585-7588.

[13] GB/T 31520-2015다Haematococcus pluvialis-액체크로마토그래피법에서 astaxanthin의 측정 [P].중국, 2015년.

[14] Yuan J P,Chen F. Haematococcus pluvialis[J] 추출물로부터 트랜스 아스타잔틴의 크로마토그래피 분리 및 정제 (Chromatographic separation and purification of trans-astaxanthin from the extracts of Haematococcus pluvialis)한국농식품화학학회지,1998,46(8):3371-3375.

[15] Sun Weihong, Xiao Ronghui, Leng Kailiang 외.C30-reversed-phase high performance liquid 색 층 분석법method for determination of astaxanthin in Haematococcus pluvialis (J.분석시험학회지 2010, 29 (8):841-845.

[16] [16]리 Y아 묘 F, Geng 아직 알다. 정확 한 quantification  of astaxanthin  from  Haematococcus  원유 extract  spectrophoto-metrically다 [J다]중국해양및림상학회지 2012,30(4):627-637.

[17] Zhou Jinke, Li Jinhua, Ge Fahuan 외.Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin을 추출하는 새로운 효소법에 대한 연구 (Research on a new enzyme method for extracting astaxanthin from Haematococcus pluvialis [J])중국materia, 2008, 31(9):1423-1425.

[18] Seely G R,Vidaver W E,Duncan M J. 갈조류로부터 색소를 dimethyl sulfoxide로 준비 및 분석 추출 [J.해양 생물학, 1972년, 12 (2):184-188다.

[19] Boussiba S, Vonshak a. Astaxanthin 축적 in  the  green  alga  Haematococcus  pluvialis다 [J다]식물 and   세포 생리학, 1991년, 32 (7):1077-1082.

[20]Orosa M,Franqueira D,Cid A,et al.Analysis and enhancement of astaxanthin accumulation in Haematococcus pluvialis (J.구라 기술, 2005년, 96 (3):373-378다.

[21]Boussiba S,Bing W,Yuan J P,et al. Changes in pigments profile in the green alga Haeamtococcus pluvialis exposed to environmental stress [J].생명공학 편지, 1999년, 21일 (7):601-604다.

[22]Breithaupt D. E.Identification and quantification of astaxanthin esters in shrimp(Pandalus borealis)and a microalga (Haematococcus pluvialis)에 의해 liquid  chromatography  대량 spectrometry using  negative  ion  대기 압력 화학 이온화 [J].한국농식품화학학회지,2004,52(12):3870-3875.

[23]Miao F P,Lu D Y,Li Y G,et al. liquid chromatography에 의한 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthinesters의 특성-

대기압 화학 이온화 질량 분석기 [J.2006년 분석 생화학, 352 (2):176-181다.

[24] Holtin K, Kuehnle M, Rehbein J, et  알다. 결단력 of  astaxanthin  and  astaxanthin  esters  in  the   미세조류 Haematococcus pluvialis by LC-(APCI)MS and characteristics of predominant carotenoid isomer by NMR spectroscopy [J].2009,395(6):1613-1622.

[25] 천싱케이 (Chen Xingcai), 황위광 (Huang Weiguang), 진우양 (Ouyang Qin)astaxanthin esters의 Saponification and purification and separation of free astaxanthin from Haematococcus pluvialis [J].푸저우대학 (자연과학편), 2005, 33 (2):264-268.

[26] Yuan J P,Chen F.Hydrolysis kineticsofastaxanthinesters and stability ofastaxanthin of Haematococcus pluvialis during saponification[J].한국농식품화학학회지,1999,47(1):31-35.

[27]Zhao Y,Guan F,Wang G,et al.Astaxanthin preparation by lipase-catalyzed hydrolysis of its esters from Haematococcus pluvialis algal extracts[J].한국식품과학회지 2011,76(4):C643-C650.

[28] 제이콥스 P B, 르뵈프 R D 맥콤마 S A, 외. 콜레스테롤 esterase[J]에 의한 카로티노이드 에스터의 분열.비교생화학 및 생리학 B-Biochemistry &분자 생물학, 1982년, 72 (1):157-160다.

[29]. 성진풍, 장희민, 양장경 외.Haematococcus pluvialis의 astaxanthin 함량의 신속한 측정방법 (A rapid method for determination of astaxanthin in Haematococcus pluvialis [J.식품연구개발, 2016, 37(12):125-128.

[30] Yuan J P,Chen f. HPLC-photodiode array detection에 의한 Haematococcus lacustris의 astaxanthin 이성질체 확인 [J].1997년 생명공학 기술, 11 (7):455-459.

[31]Peng J,Xiang W,Tang Q 등 HPLC에 의한 Haematococcus pluvialis 및 기타 녹조류의 돌연변이 E1에서 astaxanthin과 그 에스테르를 C30 column[J]로 비교 분석하였다.중국의 과학 시리즈 C-Life Sciences,2008,51(12):1108-1115.

[32] Haematococcus pluvialis[J] 로부터 복합 astaxanthin ester 혼합물의 MALDI-TOF/TOF-MS 스펙트럼의 진단적 가치를 높이기 위한 도구로서 Weesepoel Y,Vincken J-P,Pop R M,et al.Sodiation.한국질량분석학회지 2013, 48(7):862-874.