Haematococcus Pluvialis Astaxanthin 검사방법 4

Astaxanthin, 화학적으로 명명된 3,3'-dihydroxy-beta, beta'-carotene-4, 4'-디오네, 케토카로티노이드에 속한다.연구에 따르면 아스타잔틴은 가장 강력한 천연 항산화 물질이라고 합니다 [1-2].아스타잔틴은 항산화, 항방사선, 항노화, 항종양, 심혈관 질환 예방 및 치료 기능 [2-3]을 가지고 있으므로 경제적 가치가 극히 높다.보건품, 의약품, 사료첨가제, 화장품, 기능식품, 식품첨가물, 기타 영역 [4]에 사용되고 있다.

아스타잔틴 생산의 주요 원료는 새우와게 껍질 [3, 5], 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcuspluvialis) [4]와 로도토룰라 글루티니스 (Rhodotorula glutinis) [6]에서 나온다.그 중 Haematococcuspluvialis는 스트레스 조건에서 건조 중량의 5%까지 astaxanthin을 축적할 수 있다.아스타잔틴의 구조는 2개의 키랄 C 원자를 포함하고 있기 때문에, 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 에서의 구조는 3S, 3S&이다#39;, 그리고 합성 형태는 키랄 혼합물, 주로 3R, 3R'.헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)는 천연 아스타잔틴 생성의 가장 좋은 원천으로 여겨진다.

Haematococcus pluvialis는 스트레스를 받은 후 젤리 같은 조개 같은 외벽을 형성한다.세포 내 색소를 추출할 때 기존의 용매로는 세포 내부로 들어가기 어려워 색소를 추출할 수 없었다.보통 셀 벽 깨기 방법을 병행할 필요가 있다.둘째, Haematococcus pluvialis 세포의 astaxanthin은 주로 astaxanthinester의 형태로 존재하는데, 즉, 아실 사슬이 다른 astaxanth에서monoester 분자와 astaxanthindiester 분자가 있다.HPLC 분석은 모든 분자의 기준분리가 어렵고, 함량을 계산할 때 분자량이 다르다.

또한 astaxanthin은 불안정하여 빛이나 열과 같은 조건에서 분해되기 쉬우므로 astaxanthin의 정확한 판별에는 일정한 문제가 있다.본 논문은의 추출, 가수분해, 검출 측면에서 현재의 연구 현황을 검토한다Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin, 다양한 목적으로 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 아스타잔틴 함량을 신속하게 결정하기 위한 적절한 방법의 선택에 대한 지침을 제공하는 것을 목적으로 한다.

헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)에서 아스타잔틴 추출 1

astaxanthin의 추출은 그 함량을 정확하게 판별하기 위한 기초이며 또한 astaxanthin측정의 불확실한 측면 중 하나이다.스트레스 상태에서 헤마토코쿠스 플러비알리스 세포는 아스타잔틴을 축적하지만, 세포의 성장과 분열이 멈추어 움직일 수 없는 포자, 즉 젤리 모양의 세포를 형성한다.성숙한 젤리성 세포는 3 층 두께의 단단한 세포벽을 가지며, 가장 바깥층은 아세트산 가수분해에 강한 저항성을 갖는 물질인 알가난 (algaenan)이다.두 번째와 세 번째 층은 각각 만노스와 셀룰로오스가 균일하고 균일하지 않게 분포되어 있다 [7].

젤리 같은 세포벽을 가진 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 경우 기존의 분해 및 추출 방법으로는 세포 내부로 접근하여 색소를 추출할 수 없다.

현재 업계에서는 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 로부터 아스타잔틴을 추출하기 위해 초임계 CO2 추출 기술 [7], 고압/초고압 균질화 추출 기술 [8], 음압 cavitat이온법 [9] 등을 사용하고 있다.상기 방법은 아스타잔틴을 효과적으로 추출할 수 있지만, 다량의 알를로스 분말이 필요하고 작동이 복잡하므로 대규모 산업 생산에 적합하다.Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin을 검출하기 위해 사용되는 추출방법에는 용매추출, 기계연마 + 용매추출, dimethyl sulfoxide (DMSO) 추출, cellulase 벽깨기 + 용매추출 등이 있다.

1.1 용매 추출법

용매 추출법은 조작이 쉽고 비용이 저렴하며 장비 요구량이 적다.추출 용매, 액체 대 용매 비율, 추출 온도, 추출 시간만 최적화하면 된다.일반적으로 사용되는 용매로는 아세톤 [10], 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 에탄올 등이 있다.그러나 헤마토코쿠스 플러그알리스 (Haematococcus pluvialis)의 젤리 같은 껍질 외벽 때문에 기존의 용매는 세포 내로 들어갈 수 없으며, 아스타잔틴의 추출률은 낮다.Mendes-Pinto 등은 Haematococcus pluvialis 로부터 astaxanthin의 추출용매로 아세톤을 사용하였으며, 추출율은 4 mg ·g-1 (알조가루 1g 당 추출된 astaxanth에서mass)에 불과하였으나, 기계적 분쇄 + 아세톤 추출은 19 mg ·g-1로 용매가 세포내로 들어가 astaxanthin을 추출할 수 없음을 알 수 있었다 [10].

Ruen-ngam은 초음파 (ultrasonic assisted 추출), 마이크로파 (microwave assisted 추출), Soxhlet 추출 (Soxhlet 추출)에 의한 용매 추출 방법을 비교하였다.75 °C에서 5분간 마이크로파 보조 추출을 이용하여 아스타잔틴의 추출률은 74%에 달했다 [11].또한, 용매의 추출 효율을 높이기 위해 화학적 세포벽 붕괴는 Haematococcus pluvialis 세포를 산 또는 알칼리로 처리하는 것을 포함한다.Sarada 등은 세포를 70 °C에서 2 mol·L-1 염산 용액으로 2분간 처리한 후 용매로 추출하면 86%-94%의 아스타잔틴 추출율을 얻을 수 있다고 보고하였다 [12].그러나 고농도의 산 또는 알칼리 용액에 astaxanthin을 넣으면 astaxanthin이 쉽게 분해될 수 있다는 점에 주목할 필요가 있다.이상의 결과는 Haematococcus pluvialis의 특수한 세포벽 조성으로 인해 직접 용매 추출은 세포 내로 들어갈 수 없는 반면, 보조 초음파, 마이크로웨이브 및 산-염기 처리는 모두 astaxanthin의 분해를 유발하기 쉬워 astaxanthin 추출에 적합하지 않음을 보여준다.

1.2기계 세포벽 파괴 + 용매 추출

기계적 세포벽 파괴 (Mechanical cell wall disruption)는 실험실에서 가장 일반적으로 사용되는 방법으로 외부의 힘을 이용하여 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 세포벽을 파괴하는 방법이다.의 검출을 위한 국가 표준에서Haematococcus pluvialis에서 astaxanthinGB/T 31520-2015 [13], Haematococcus pluvialis는 유리 균질기를 사용하여 완전히 갈아내고, 그 안료는 디클로로메탄-메탄올을 용매로 사용하여 추출한다.기계적 파쇄 + 용매 추출법은 아스타잔틴 (astaxanthin)의 검출에 더 일반적으로 사용된다 [10, 14-16].기계적인 분쇄는 세포벽을 손상시킬 수 있으며, 색소는 완전히 추출될 수 있습니다.이 방법은 조작이 간단하지만,이 방법은 각 시료를 세포 균질기를 통해 갈아야 하므로 시간이 많이 걸리고 고생이 많다.

1.3 셀룰라아제 벽 파괴 + 용매 추출

헤마토코쿠스의 세포벽은 주로 셀룰로오스, 펙틴, lipopolysaccharides 등의 물질로 구성되어 있기 때문에 [8] 헤마토코쿠스의 세포벽을 부수기 위해 셀룰라제, 펙티나제, 다당류 등이 사용된다.저우진크 등은 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) [17]에서 아스타잔틴을 추출하는 새로운 효소법을 연구했다.Cellulase:알갈분말의 효소가수분해, 에탄올 추출.효소추출을 위한 최적공정조건은 효소용액의 초기 pH 4.5, 효소가수분해온도 45 °C, 효소용량 1.5%, 효소가수분해시간 15시간이며, 이러한 조건하에서 아스타잔틴 추출율은 94.6%로 기존의 직접 에탄올 추출법보다 61.5% 높았다.작동 온도가 낮고 오염이 적으며 비용이 저렴하고 추출률이 높은 장점이 있다.녹색 산업 생산을 달성하기 쉽지만,이 방법은 시간이 많이 걸리고, 높은 온도 또한 astaxanthin의 저하를 일으킬 수 있습니다.

1.4 DMSO 추출법

DMSO는 다양한 용매와의 miscibility와 cell에 대한 투과성이 좋다.약물이나 살충제의 침투강화제, 세포의 냉동보존시 보호제로 많이 쓰인다.실리는 DMSO를 이용해 미녹조 엽록소와 카로티노이드를 추출할 수 있다고 처음 보고했다 [18]..Boussiba 등은 DMSO를 이용하여 Haematococcus pluvialis 로부터 색소를 추출하였다.추출은 70 °C 수조에서 10분간 수행하였으며, 70 °C 수조에서 2~3회 추출을 반복함으로써 알류 잔류물을 무색으로 만들 수 있으며 [19], DMSO는 투과성이 우수하고 아스타잔틴을 완전히 추출하기 위해 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)의 세포로 침투할 수 있음을 보여준다.DMSO 추출은 Haematococcus pluvialis의 세포벽을 처리할 필요가 없어 astaxanthin 추출 과정을 크게 단순화시키며, astaxanthin 검출에 사용되고 있다 [20-21].또한, 월드 &#Cyanotech, 일본의 Fuji, China& 등 대표적인 미세조류 기업 39개사#39;s Green A 생명공학 회사 [8]는 모두 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis)에서 아스타잔틴을 추출하는 DMSO 방법을 아스타잔틴 검출에 적용했다.

DMSO를 부종제로 사용하면 세포벽의 투과도를 높일 수 있으며, Haematococcus pluvialis의 검출에 필요한 세포벽 파괴 과정을 간소화하여 Haematococcus pluvialis 로부터 astaxanthin의 추출제로 사용할 수 있다.

아스타잔틴 에스터의 가수분해 2

Haematococcus pluvialis에 축적된 astaxanthin은 all-trans 3S, 3S '는, 각 내환식 구조에 하나의 히드록시기를 갖는, 구성.보통 C16, C18 또는 C20 지방산과 에스테르화하여 아스타잔틴 에스테르를 형성하여 구조를 안정화시킨다 [22].대부분은 아스타잔틴 monoester 이며, 약 75%, 아스타잔틴 diester 가 약 20%, 프리 아스타잔틴이 겨우 5% [12, 23]를 차지한다.헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) [24]의 아스타잔틴 모노에스테르와 디에스테르에는 무려 30가지의 종류가 있다.astaxanthin 에스테르의 복잡성은 정화 및 직접적이고 정확한 정량화에 문제가 있습니다.따라서 추출 된 아스타잔틴 에스테르들은 단일 물질의 정제와 HPLC에 의한 정확한 정량을 얻기 위해 자유 아스타잔틴으로 가수 분해될 필요가 있다.일반적으로 아스타잔틴에스테르를 가수분해하는 방법에는 saponification과 효소 가수분해 두 가지가 있다.

2. 1 Saponification

Saponification은 일반적으로 NaOH 또는 KOH 메탄올 용액에서 수행되어 아스타잔틴 에스테르를 자유 아스타잔틴으로 가수분해한다.Yuan 등은 saponification 중 높은 알칼리 농도나 반응 온도는 astaxanthin ester의 가수분해에 도움이 되지만, astaxanthin의 분해를 가속화하기도 한다 [14].또한 Chen Xingcai 등은 free astaxanthin의 농도가 알칼리 농도가 증가함에 따라 선형적으로 감소하는 것을 보여주었다 [25].Yuan 등은 ester saponification에 따른 astaxanthin의 가수분해 운동성과 알칼리 농도에 따른 astaxanthin의 분해를 연구하였다.그 결과 NaOH 농도가 0.0175~0.020 mol · L-1인 22 °C 반응계에서 아스타잔틴 에스테르가 완전히 가수분해되어 아스타잔틴 분해가 일어나지 않았다.그러나 나오-메탄올 용액의 농도가 높아지거나 반응온도가 높아지면 [26] 아스타잔틴이 크게 분해되었다.아스타잔틴 에스테르를 위한 석화 방법의 조건은 가혹하다.알칼리 용액의 농도, 석출과정 중의 석출온도 및 시간은 모두 석출의 효율과 아스타잔틴의 안정성에 영향을 미치며, 이는 아스타잔틴의 정확한 판정에 영향을 미치는 또 다른 측면이다.

2.2 효소 가수분해 방법

Zhao는 Penicilium cyclopium에서 나오는 수용성 알칼리 에스테라제 (esterase) 가 아스타잔틴 에스테르를 아스타잔틴으로 변환 할 수 있다고 보고했다.반응조건은 28 °C에서 7 h 동안 교반하면서 배양하였으며, astaxanthin의 회수율은 63.2%에 달했다 [27].그러나이 효소는 가수분해 효율이 낮아 아스타잔틴 함량 측정에 널리 사용되지 않았다.제이콥스는 지용성 콜레스테롤 에스테라아제가 카로티노이드 에스테르를 빠르게 가수분해할 수 있다는 사실을 처음 보고했다 [28].현재이 효소법에 대한 문헌보고는 거의 없지만, 완만한 가수분해 방법으로 astaxanthin을 생산하는 국내외 기업에서 사용하고 있다.사용된 콜레스테롤 esterase는 아스타잔틴 에스테르를 완전히 가수분해할뿐만 아니라 아스타잔틴의 산화를 쉽게 일으키지 않아 아스타잔틴 함량을보다 정확하게 확인할 수 있다.

astaxanthin을 함유한 Haematococcus pluvialis 추출물에 콜레스테롤 esterase를 단기간 사용하면 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin의 검출 효율이 크게 향상됩니다.

Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin의 정량 검출 3

아스타잔틴을 검출하는 주요 방법은 분광광도법, 가수분해효소 (hydrolysis-HPLC), HPLC-MS 등이 있다.

3. 1 Spectrophotometry

Boussiba는 Haematococcus pluvialis의 엽록소가 5% KOH-30% methanol 용액으로 약 10분간 가열하여 파괴되었음을 보고한 후 DMSO로 astaxanthin을 추출하였다.흡광도는 475 nm의 파장에서 측정하여 astaxanthin 농도를 계산하였다.이 방법은 아스타잔틴의 함량을 신속히 추정할수 있어 재배와 생산에 널리 리용되고있다 [12, 29].다만이 방법으로 엽록소를 파괴하기 위해 알칼리 용액을 처리하면 아스타잔틴이 25%~40% 정도 분해된다는 보고도 있다 [16].

따라서 Li 등은 Boussiba&를 개선하였다#39;s 방법은 알칼리 처리없이 DMSO에서 직접 추출하고, 530 nm의 가시광선 파장에서 검출하여 다른 카로티노이드 및 엽록소의 간섭을 피한다.이 방법은 헤마토코쿠스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) [16]의 아스타잔틴 함량의 신속한 검출을 위해 사용되었다.Geng Jinfeng's 연구결과 재배과정 중 Haematococcus pluvialis의 carotenoids와 astaxanthin의 함량은 안정적인 선형관계에 있는 것으로 나타났다.직접적이고 쉽게 carotenoids를 측정하여 간접적으로 astaxanthin의 함량을 구하는 방법을 이용하면 carotenoids의 함량을 빠르게 확인할 수 있으며, 얻어진 carotenoids와 astaxanthin의 상관관계를 바탕으로 Haematococcus pluvialis의 astaxanthin 함량을 빠르게 계산할 수 있다.본 실험실의 데이터도 분광광도법으로 측정된 카로티노이드 함량과 효소가수분해물-hplc로 측정된 astaxanthin 함량 사이에 좋은 선형 관계가 있음을 보여준다 (그림 1). 따라서 DMSO 추출법은 475 nm에서 분광광도법을 이용하여 astaxanthin 함량을 직접 확인할 수 있으며 그림 1의 관계를 확인할 수 있다.

3.2가수분해-hplc 법

Haematococcus pluvialis 색소를 saponification 또는 효소 가수분해에 의해 전처리 한 후, HPLC를 사용하여 자유 astaxanthin을 정확하게 확인할 수 있습니다.현재 astaxanthin 결정 GB/T 31520-2015 국가 표준은 결정을 위해 saponification 후 HPLC 방법을 사용한다 [13].분리 컬럼은 역상 C30 컬럼이며, 전트랜스가 없는 astaxanthin, 9-cis-astaxanthin, 13-cis-astaxanthin을 20분만에 검출할 수 있다 Yuan은 C18 컬럼을 이용하여 saponin으로 에스테르화된 astaxanthin을 분석하였다.구배 용출을 위한 이동상으로 메탄올/디클로로메탄/아세토니트릴/물을 사용하였으며, 단일시료를 16분 만에 검출하였다 [30].Cyanotech's, Haematococcus pluvialis의 함량을 확인하는 방법은 색소를 추출한 후 가수분해하여 HPLC 결정을 하는 것이다.이 가수분해에 의한 전처리는 astaxanthin ester를 astaxanthin으로 전환시켜 astaxanthin 화합물이 포함된 혼합성분을 하나의 astaxanthin 성분의 검출로 전환시켜 HPLC 분석이보다 간단하여 정확한 정량이 가능하며, 높은 반복성을 갖는다.이상의 아스타잔틴 역상 크로마토그래피 분리 조건을 하기 표 1에 요약하였다.

3.3 HPLC-MS 방식

astaxanthin과 그 에스테르 유도체를 추출하는 다양성과 복잡성으로 인해, 전통적인 분광 광도법 및 HPLC 방법은 다른 astaxanthin 에스테르 분자 사이의 차이를 식별할 수 없습니다.질량분석기는 아스타잔틴 에스터 분자 간의 질량과 조각 정보의 차이를 이용하여 다른 분자들을 더 잘 구분할 수 있으며, 이후 정성 및 정량 분석을 수행할 수 있다.추출된 색소 시료를 처리 없이 HPLC/MS로 직접 측정하는 방법은 saponification 과정에서 astaxanthin의 분해를 피할 수 있으며, astaxanthin, astaxanthin 에스테르, 기타 carotenoids 및 엽록소를 동시에 측정할 수 있다.

그것은 아스타잔틴 조성 결정과 아스타잔틴 대사 기전 연구에 특정 응용이 있다.Holtin 등은 LC-(APCI)MS를 이용하여 자유 아스타잔틴 이성질체, 아스타잔틴 모노에스터, 아스타잔틴 디에스터, 그리고 Haematococcus pluvialis [24]의 루테인을 정성적으로 분석하였다.Weesepoel 등은 ESI-IT와 MADIL-TOF/TOF를 이용하여 Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin ester acyl chain의 결정 및 cis와 트랜스 이성질체의 구분 등 [32]보다 상세한 astaxanthin ester의 분석을 수행하였다.아스타잔틴 및 이의 에스테르 유도체의보다 많은 크로마토그래피 분리 결과를 하기 표 1에 요약하였다.카로티노이드 및 아스타잔틴 에스테르류의 낮은 극성이 일반적으로 사용되는 연이온화 ESI 이온 소스를 사용하여 이온화하는 것을 어렵게 한다는 점에 주목할 필요가 있다.APCI 이온 원료는 astaxanthin esters의 분석에 더 일반적으로 사용됩니다.

본 논문은의 추출, 가수분해 및 검출을 위한 현재의 방법들을 검토하고 평가한다Haematococcus pluvialis에서 astaxanthin다.아스타잔틴 함량은 DMSO로 추출한 후 475 nm 파장에서 분광광도법으로 직접 측정한다.아스타잔틴 함량은 분광광도법으로 측정된 카로티노이드 함량과 HPLC로 측정된 아스타잔틴 함량의 선형 관계를 바탕으로 빠르게 계산된다.이 방법은 연구 중 중요한 매개변수를 빠르게 얻는 데 더 도움이 된다.DMSO 추출 후, 가수분해를 위해 콜레스테롤 esterase를 사용하고, 아스타잔틴의 함량을 정확하게 결정하는 방법으로 사용될 수 있는 자유 아스타잔틴의 함량을 확인하기 위해 HPLC를 사용한다.다른 검출 목적을 위해, 다른 방법을 분석에 사용할 수 있으며, 다른 실험실 또는 방법 간의 데이터 비교는 추출 된 시료의 가수분해 처리 및 HPLC 분석 후 결과에 교정해야합니다.

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