효소적으로 변형된 스테비아 글루코실 스테비아를 얻는 방법은?

1 서문

거의 반세기 동안, 과학자들은 비만과 3대 고지대 (고혈압, 고혈당, 고혈중지질)의 발생을 줄이기 위해 수크로스와 맛이 비슷하지만 수크로스를 대체할 에너지 값이 더 낮은 감미료를 찾는 데 전념해 왔습니다.현재 인공감미료로는 아세설팜, 알리타메, 아스파탐, 시클라메이트, 수크랄로스, 네오타메 등이 있다.생활수준이 부단히 향상되면서 사람들은 천연식품과 친환경식품을 추구하기 시작했다.스테비아는 천연 감미료가 돋보입니다.단맛은 자당의 250~400배이다.스테비아는 Asteraceae 과의 Stevia rebaudiana Berton 허브에서 추출한다.주요 성분은 식물의 잎에 축적된 이차대사산물인 stevioside (ST)와 rebaudioside A (RA)이다 (화학구조는 그림 1 참조).예를 들면 2차 대사산물인 stevioside (ST)와 rebaudioside A (RA) 가 있다 (화학 구조는 그림 1 참조).

스테비오사이드 연구는 지난 세기 초에 시작되었다.현재까지 스테비오사이드에 관한 과학 논문과 특허는 전 세계적으로 1,000건 이상이며, 대부분은 스테비오사이드 추출 기술, 맛 개선 및 안전성 및 생체 시료를 기반으로 한 독성학 연구에 초점을 맞추고 있다.과거 스테비아 섭취는 인체 독성학 및 신진대사 자료가 불완전해 안전성이 논란이 됐고, 한국과 일본에서만 다량 사용됐다.여러 나라에서 수년간의 종합적인 연구를 거쳐, FAO/WHO 합동 식품첨가물 전문가위원회 (JECFA)는 2008년 6월 제69차 회의 보고서에서 스테비아는 하루 섭취량이 체중 4mg/kg 이하일 때 인체에 부작용이 없다고 명확히 밝혔다.같은 해 12월 미국 식품의약국 (FDA)은 미국 시장에 출시된 고순도 스테비아 A 글리코사이드 (RA 함량 95% 이상) 제품의 안전성 및 신뢰성 (GRAS) 인증 신청을'반대 없음'의견으로 승인했다.이는 유럽과 미국의 식품 산업 시장에서 스테비아가 널리 사용되는 시작을 알렸다.단맛이 높고 칼로리가 낮은 천연 감미료인 스테비아는 자당 [1-3]의 대용품이 될 것이다.

2기술적 진보 (Technological progress)

30년 이상의 공업화 과정을 거쳐 스테비아는 3세대로 발전했는데, 1세대 스테비아는 스테비오사이드, 2세대는 ST와 RA의 혼합이며, 3세대는 주로 is RA이다.단맛 및 그 특성을 하기 표 1에 나타내었다.스테비아의 준비 과정은 주로 다음과 같은 단계를 포함합니다:스테비아 잎 건조 및 분쇄, 액상 추출, 불순물 제거, 수지 처리, 분무 건조 및 정제.

2. 1 추출

초기 싹이 돋는 단계의 스테비아 잎은 스테비아 함량이 가장 높다.이 단계의 잎을 건조시키고 분쇄한 후, 극성 용매 액상 추출은 보통 뜨거운 물이나 알코올과 같은 스테비아를 추출하는데 사용된다.초임계 이산화탄소 추출은 아직 산업에는 적용되지 않고 있다.잎에 있는 기름, 엽록소, 에센셜 오일 등의 비극성 물질은 추출 전에 클로로포름이나 헥산으로 제거할 수 있다 [4-5].추출 방법에는 탱크 일괄 추출과 반류 연속 추출 [6]의 두 가지가 있다.스테비아 추출물은 원심 분리, 판 및 프레임 필터 누르기, 막 여과 [7-8]로 깨진 잎과 기타 고체 불순물을 제거하여 얻는다.

2.2 불순물 제거

스테비아의 분리와 정화:Thestevia 추출단백질, 유기산, 탄닌, 사포닌, 색소, 무기염 등의 불순물을 다량 함유하고 있다.이 불순물의 함량은 글리코사이드 함량의 5~7배이다 [9].스테비아 추출물로부터 스테비아를 분리, 정제하기 위해서는 컬럼 크로마토그래피 (Column chromatography) 또는 막여과 (membrane filtration)를 이용하는 것이 일반적이다 [10-25].

컬럼 크로마토그래피를 이용하여 스테비오사이드를 분리, 정제할 때에는 먼저 스테비아 추출물을 전처리하여야 한다.그렇지 않으면, 한편으로는 액상 사료의 안료 등의 불순물이 수지를 오염시켜 수지가 대량의 색소를 흡착시키고 글리코사이드의 흡착을 감소시키며, 흡착 주기를 단축시키고, 알코올과 글리코사이드의 손실을 증가시키고, 추출 속도를 감소시키며,  생산 비용 상승.반면에 액체중의 일부 금속이온은 수지의 영구적중독을 초래하여 수지의 사용수명을 감소시키고 생산의 정상적인 진행에 영향줄수 있다.셋째, 제품이 음료 생산에 사용될 때 충진 중 침전 및 기포 등의 문제가 발생하여 광범위한 사용에 영향을 미칠 수 있다.

따라서 수산화 칼슘과 황산철은 스테비아 액체의 불순물을 제거하는 데 도움이 되는 흔합물로 사용됩니다.칼슘염은 구연산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 아스코르브산, 옥살산 등의 유기산과 불용성 칼슘염을 형성하여 침전시킬 뿐만 아니라 폴리페놀, 단백질, 다당류, 엽록소, 카로틴, 루테인 등의 색소와 불용성 칼슘염을 형성하여 침전시킬 수 있다.철염은 탄닌과 동, 아연, 알루미늄, 칼슘 등 금속염을 침전시킬수 있다.스테비아 추출물의 일부 유색물질, 단백질 및 이물질을 제거하기 위해 전처리를 한 후, 추출물의 스테비오사이드를 대성 수지에 의해 선택적으로 흡착시킨 후, 물 또는 유기용매로 용출한다.용출 물의 염, 대부분의 안료 및 기타 극성 불순물은 음이온 및 케이션 교환 수지에 의해 제거되어 스테비오사이드 농축 용액 [26]을 얻는다.

2.3 수지처리

중국에서 수지를 이용한 스테비아 액체의 정제에 대한 연구는 1982년부터 시작되었다.천더창 등은 1984년 중국 최초로 장쑤성 장성시에 수지를 이용해 스테비아를 정화하는 공장을 설립했다.

일반적으로 사용되는 케이션교환수지는 Amberlite IR-120B, 001×14.5 등이 있고, 음이온교환수지는 Amberlite IRA-93, D-280 등이 있다.흡착수지는 Amberlite XAD-2, AB-8, Diaion Hp-20, ADS-7,D107, D108 등이 될 수 있다 [27-30].

막여과를 이용하여 스테비오사이드를 분리, 정제할 때 세라믹 미세기공, 초미세여과막, 나노여과막을 통한 여과를 통해 스테비아 액체로부터 스테비오사이드와 분자량이 크게 다른 이온성 화합물과 유기분자를 제거하여 스테비오사이드가 농축된 액체 [31]를 얻을 수 있다.1998년 캐나다 국립연구위원회는 막여과를 이용하여 스테비아를 정화하는 방법을 개발하여 [32] 미국에서 특허를 받았다.

2.4분무건조

농축 된 액체는 냉각 결정화, 농도 결정화 또는 분무 건조를 거쳐 어두운 색상과 주성분 ST 및 RA를 갖는 조잡한 스테비아 제품을 얻을 수 있습니다.활성탄을 사용하여 결정화 또는 분무 건조 전에 제품을 탈색하여 백색 제품을 얻을 수 있습니다.중국의 스테비아 제조사들은 대부분 이런 종류의 제품을 생산한다 [3].

2. 5 정제

RA 또는 ST에 풍부한 정제 스테비아:친수성 용매에서 ST와 RA 간의 용해도의 차이로 인해, 조제된 스테비아를 메탄올이나 에탄올과 같은 용매에 용해시켜 포화 농도로 만든 다음, 농도 및 냉각 등의 방법으로 ST 또는 RA 결정을 선택적으로 침전시킬 수 있다.고순도 RA를 보장하기 위해 결정을 에탄올-물 용액에 다시 용해시키고, 불용성 불순물을 제거하기 위해 여과한 다음 스프레이 건조 또는 농축하여 제품을 결정화할 수 있습니다.

3가지 분석 방법

스테비오사이드의 정성 및 정량 분석은 색량, 강수량, 기체 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 및 기타 방법을 사용하여 수행 할 수 있다.China's 국가표준 GB8270-1999는 ST 함량에 대한 시험표준과 방법을 규정하고 있다.그러나 RA의 검출에 대한 공식적인 기준은 없다.FCC (Food Chemicals Codex)는 2008년에 공개 토론 초안을 발표하여 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 RA와 ST의 결정을 표준화하였다.크로마토그래피 컬럼으로 아미노기 컬럼이나 당 분석 컬럼을 사용하였고, 이동상 [34]으로 아세토니트릴-물 혼합용액을 사용하였다.

맛 개선 4

스테비오사이드는 주로 음료, 요구르트, 디저트, 테이블탑 감미료 [35]에 저칼로리 감미료로 사용된다.ST는 쓴맛과 멘솔맛이 어느 정도 나며 단맛 특성이 완벽하지 않다.RA's의 단맛 특성은 세인트보다 수크로스에 가깝지만, 라를 정화하는 것이 더 복잡하기 때문에, 97%의 라를 함유 한 스테비아는 여전히 세인트의 특정 뒷맛이 있습니다 스테비아의 맛을 개선하는 세 가지 주요 방법이 있습니다.

4.1 다른 풍미 증진제를 첨가하여 복합 감미료를 만든다

ST를 다른 맛 마스킹제 및 감미 증진제와 혼합하여 복합 감미료가 형성됩니다.다양한 감미료와 생리적 특성 간의 시너지 효과를 이용함으로써 불쾌한 입맛을 줄이고 맛이 생기는데 걸리는 시간을 단축시키며 단맛의 안정성과 풍부함을 향상시킬 수 있다.하나의 감미료의 특별한 기능을 유지할 수 있고, 새로운 맛을 낼 수 있으며, 비용을 절감할 수 있다 [36~40].

스테비아의 RA 함량 증가 4.2

감미료 함량이 더 높은 식물이나 새로운 감미료를 찾기 위해 식물학자들은 남아메리카의 Asteraceae 과에 속하는 식물 220여종을 연구했다.그러나, Stevia phlebophylla 라는 단 하나의 식물만이 Stevia rebaudiana Bertoni와 같은 ST를 함유하고 있는 것으로 밝혀졌다.이 식물은 1899년에 발견되었고 지금은 멸종되었다.

RA 함량이 높은 스테비아 재배는 수십 년 전부터 진행되어 왔으며, 일본은 스테비아 품종 개량 및 응용에 관한 연구가 가장 잘 이루어지고 있는 국가 중 하나이다.우리 나라 자체에서 재배하는 일부 스테비아 품종 외에 최근 중국에서 사용되는 스테비아 품종은 주로 일본에서 온 것이다.일본 품종 모리타는 비교적 저렴한 가격과 우수한 품질 특성으로 중국 스테비아 재배분야의 큰 시장 점유율을 차지하고 있다.그러나 품종이 심각하게 퇴화되고 있어 China&의 근원의 안정과 발전에 부정적인 영향을 미치고 있다#39;s 스테비아 산업.남경식물연구원, 청도천성회사, 산동화산스테비아유한회사, 연천시아강스테비아무역유한회사 등 중국 각 단위에서도 당질 함량이 더 높은 품종을 개발했다.표 2는 일부 스테비아 품종의 말린 잎에 함유되어 있는 스테비오사이드 함량을 나타낸 것이다 [41-43].

식물의 RA 함량을 증가시키기 위해 새로운 품종을 육성하는 것 외에도, ST를 RA로 전환하는 화학적인 방법도 보고되었다 [44].ST와 RA 사이의 차이점을 포도당 단위의 개수에 놓여 있 C13 steviol의 위치에 부착 되어 glycoside다 (그림 1 참조). 성을 RA 변환의 열쇠는 β의 선별적인 지구-sophoroside과 터미널 설탕 stevioside 분자의 에테르 연결 효소에 의해"Takadiastase Y"미생물에서 추출 균은 oryzae, 제품 Rubusoside를 얻을 수 있습니다.glycoside 분자 β-sophoroside과 터미널 glycoside 에테르 연결은 선택적으로 hydrolyzed 제품 stevioside를 얻을, Rubusoside다.Rubusoside는 장미과 식물 Rubus suaviss mus에서 추출할 수 있는 또 다른 천연 diterpene glycoside이다.C19위치의 포도당 그룹이 알칼리 가수분해에 의해 제거 된 후, 페닐 알데히드가 아세탈을 형성하여 C13의 포도당 그룹의 하이드 록시 그룹 C4와 C6을 보호합니다.그리고 C19-카복실산 히드록실기, 그리고 C13에 붙은 포도당의 C2와 C3의 히드록실기와 C19의 카르복실산 히드록실기를 응축시켜 포도당 그룹을 첨가한 다음 수산화 바륨을 이용하여 메탄올 용액에서 보호그룹을 제거하여 RA를 얻는다.

효소 개조 4.3

효소 변형은 스테비아의 맛을 개선하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 방법입니다.단맛 생성의 메커니즘을 연구하고 효소의 촉매 효과를 이용하여 포도당 (Glc)이나 프럭토스 (Fru) 단위와 같은 특정 그룹을 ST와 RA에 첨가하여 수크로스에 가까운 맛을 낸다.Enzyme-modified stevia자당 [45~47]보다 100배 정도 달다.

(1) α-1을 사용, 4-glucosidase (예를들어, cyclodextrin glucanotransferase), 포도당 단위는 stevioside에 추가 α를 통해-addition 반응 stevia의 뒷맛을 향상시 킬 수 있습니다.그러나, 효소 반응이 진행 되는 것처럼, 수산기 4번 째 그룹의 포도당이 stevioside기 마련이이 새 포도당 그룹으로 더 한층 중 α-1에 따르면, 4-addition 반응, 포도당의 긴 사슬이 형성 된다.의 달콤 함 결과 α-glucosyl stevioside는 전에 비해 45% 정도 수정% 감소 했습니다.수정 된 α의 달콤 함-glucopyranosyl stevioside는 45% 가량 감소 했습니다.β-amylase하는 데 사용 될 수 있는 자르고 긴 포도당을 단축 시키 한 체인과 제품의 질을 향상 시키다 [48-49다]

(2)를 사용 하여 β-1, 4-galactosyltransferase, 이당 류 (예:유당, α-D-galactose, 등)로 구성 되어 있는 갈 락 토 오 스와 포도당으로 사용 될 수 있 β-1, 4-galactosyl를 병행하는 소식통 포도당 그룹의 13-position에 steviol 해골 (13-G1), 두 개의 포도당 그룹에서 뿐만 아니라 1 3-G1, 두 개의 포도당 단위는 13일까지-G1 마련 (13-G2 라고 불리는 13-G3), 그리고 4 행 포도당 단위를 19 위치의 steviol 해골 (19-G1),수정은 구속력 있는 1 갈 락 토 오 단위로 β-1, 4 본드를 하나, 3 포도당 단위로 차지 했다.2007년 9월 Dainippon Ink and Chemicals Inc (Dic Fine Chemicals, Inc)는이 방법을 이용하여 ST 및 RA 유도체 GST 및 GRA를 준비하였고, 미국 특허를 취득하였다.GRA와 GST는 모두 높은 단맛을 유지하면서도 설탕과 비슷한 부드러운 단맛, 좋은 뒷맛, ST [50~51]의 쓴 뒷맛을 줄여준다.

(3) β-fructofuranosidase기 위해 사용 되는 hydrolyze 자당의 액션 아래 인산, ST와 RA에 과당 그룹을 도입하다.과당 그룹은 19-O의 6-OH과 연결 되어 있-β-glucosyl 그룹에 의해 β-2, 6 glycosidic 본드이다.

효소를 개조한 스테비아는 ST의 뒷맛을 효과적으로 조정할 수 있지만 당 섭취를 증가시켜 당뇨병 환자에게는 적합하지 않다.

국내 개발 5

중국의 식용 스테비아 개발은 1970년대 난징 중산식물원에서 시작됐다.2000년에는 차이나's 스테비아 추출물 수출은 우리보다 적었다$1 백만 명이다.2006년부터 수출이 가속화되여 2009년에는 수출량이 이미 2000년의 84배에 달하여 수출량이 약 2,500톤 (자당의 67만 5,000톤의 단맛과 맞먹음)에 달하였다.10여 개국에 수출되고 있으며 연간 생산액은 6억 위안 이상이다.중국은 세계' 스테비아 글리코사이드 [52]의 대표적인 생산자이자 수출자이다.국내 스테비아 제조업체는 주로 산동, 장쑤, 안후이, 푸젠, 허난 및 다른 장소에 집중되어 있습니다.

6 응용 프로그램

500여 년 전 파라과이 사람들은 이미 스테비아를 사용해 단차를 만들었다.스테비아는 지난 세기 남미와 중국, 일본, 한국 등 일부 아시아 국가에서 식품 첨가물로 승인을 받았다.미국 식품의약국 (FDA)은 2008년 Generaly Recognized as Safe (GRAS) 통보를 발표하면서 최소 순도 95%의 제로 칼로리 감미료로 RA를 사용하는 것에"이의가 없다"고 확인했다.

프랑스, 호주, 뉴질랜드, 스위스 등도 RA 식품첨가물 사용허가증을 발급했다.2008년, JECFA는 0-4 mg/kg body weight/day의 RA ADI를 발표하였다.스테비아 레보디아나는 소화관에서 효소에 의해 분해되지 않는다.스테비아 레보디아나는 위와 소장을 통해 대장으로 들어가 장내 미생물에 의해 발효되어 단사슬지방산을 생성한다.스테비아의 열량은 단사슬지방산에 의해 간접적으로 생성되며 약 6.3 kJ/g이다.스테비아는 유제품, 아이스크림, 사탕, 구운 제품에서 칼로리를 줄이기 위해 많은 나라에서 설탕을 대체하기 위해 사용되는 저칼로리 감미료입니다.

더욱이 스테비오사이드의 소화불량은 그 섭취가 혈당 농도의 증가를 유발하지 않으며, 혈중 인슐린 농도의 증가를 촉진하지 않아 당뇨병 환자가 사용하기에 적합하다는 것을 의미한다.이밖에 스테비아는 혈당을 낮추고 충치를 예방하며 위장을 튼튼하게하고 피로를 해소하는 등 기능이 있어 잠재적인 약효도 크다.비만, 당뇨병, 심장병, 고혈압, 동맥경화증을 앓고 있는 환자들을 지원하는 효과가 있다.

스테비아의 주성분인 ST와 RA는 산과 알칼리에 대한 열적 안정성이 우수하며, 분말 형태든 용액 형태든 빛에 매우 안정하다.장기간 보관하는 동안 곰팡이가 생기거나 변질되지 않으며, 수크로스와 마찬가지로 열처리 후에도 완제품이 갈색이 되지 않는다.탄산 음료, 차, 와인, 커피, 비스킷, 사탕, 초콜릿, 아이스크림 등의 유제품, 과일 및 야채 주스, 해산물, 육류, 약, 화장품 및 기타 일용품 [53]에 사용할 수 있다.

그 world's 2대 음료회사인 코카콜라와 펩시콜라는 스테비아가 첨가된 제품을 이미 출시했다:코카콜라는 저칼로리 음료의 출시를 촉진하고 제품 판매를 늘리기 위해 농업회사 카길사와 협력해 트루비아를 개발했고 펩시콜라는 회사 글로벌 감미료와 협력해 퓨레비아를 개발했다.

7 전망

아스파탐, 시클라메이트, 아세설팜, 사카린과 같은 전통적인 무설탕 감미료와 비교하여 스테비아는 자연적이고 안정적이며 안전하다는 장점이 있습니다.스테비아 재배는 좋은 경제적 가치가 있다.건조 스테비아 잎의 생산량은 1 무당 250~300 킬로그램이며, 글리코사이드 함량에 따라 건조 스테비아 잎의 가격이 다르다.남쪽에서는 스테비아를 일년에 두 번 수확할 수 있다;북방의 농민들은 부동한 계절에 겨울밀과 스테비아를 함께 심을수 있어 효과적으로 수입을 늘일수 있다.스테비아를 사용하여 수크로스를 대체하면 수크로스 비용의 20%에서 40% 밖에 들지 않는다.일반적으로 스테비아는 순도가 90% 이상이며 2% 수크로스 용액에서는 수크로스보다 250배, 5% 수크로스 용액에서는 수크로스보다 200배 더 달다.

스테비아는 일본과 한국에서 30년 이상 사용되었으며 음료, 식품 및 약제에 널리 사용됩니다.최근 일본에서는 스테비아 사용량이 20%에서 30%까지 증가했다.한국은 사탕무와 사탕수수를 재배하기에 적합하지 않고 완전히 자당의 수입에 의존하고 있기 때문에 자당의 대체재에 대한 수요가 많다.스테비아는 1973년 출시된 이후 한국 감미료 시장의 40%를 점유했으며, 대부분의 감미료는 한국 전통 소주에 사용된다.또한, 아이스크림, 껌, 사탕, 김치, 음료, 소스 등에 사용되는 스테비아의 양도 증가하고 있습니다.스테비아는 today&와 일맥상통한다#'자연, 친환경, 안전, 건강 관리'의 소비자 개념 39;현재, 월드 's 코카콜라, 카길, 펩시콜라 등 500대 기업이 세계적인 규모로 스테비아에 투자하고 있으며 이는 스테비아 산업의 발전을 크게 촉진할 것이다.자당의 가장 유망한 대안으로서 스테비아는 시장의 인정을 더욱 받을 것입니다.

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