감미료 D 타가토스란?

더 나은 삶의 질에 대한 요구가 증가함에 따라 식음료 감미료의 종류는 지속적으로 증가하고 있습니다.자당 등 영양감미료 외에도 비영양감미료는 열량을 거의 내지 않으며 당뇨병, 비만, 심혈관질환, 암 등의 위험을 줄일 수 있기 때문에 감미료 시장의 주류가 되고 있다.현재 일반적으로 사용되는 비 영양 감미료에는 fructooligosaccharides, erythritol, xylitol 등이 포함됩니다.최근 몇 년 동안 발견된 d-타가토스는 특별한 건강 이점이 있는 감미료로 시장 잠재력이 큽니다.

d-타가토스에 대한 소개 1

d-타가토스 (CAS87-81-0)는 자연에 존재하는 희귀한 천연 헥소스입니다.상대분자량이 180.16인 과당의 이입체 이성질체이다.수크로스와 비슷한 단맛을 가지고 있으며, 단맛은 수크로스의 92% 수준으로 사실상 불쾌한 뒷맛이나 비린 맛이 없다.자당의 칼로리의 1/3만 생산하므로 저칼로리 감미료라고 할 수 있다.혈당지수는 8로 추정된다.

타가토스는 타가토스 6-phosphate 경로를 통해 대사될 수 있으며, 일부 미생물에는 존재하지만 고등동물에는 존재하지 않는다.인간이 섭취한 타가토스 중 20% 정도만 소장에서 흡수되고, 나머지는 장내 미생물에 의해 선택적으로 분해되어 이용된다 [1].따라서 타가토스는 칼로리가 낮고 체중 조절과 당뇨병 예방 [2]의 효과가 있다.타가토스는 입안에서 낮은 수준의 산을 생성하고 치석의 pH를 낮추지 않아 법랑질 침식과 충치 발생을 효과적으로 방지한다 [3].타가토스는 또한 좋은 프리바이오틱스이다.독성학 실험 결과 타가토스는 안전하고 독성이 없는 것으로 나타났다 [4].타가토스의 건강 기능 및 응용 분야는 표 1에 나와 있다.

고혈당에 대한 타가토스의 기전 2

고혈당에 대한 타가토스의 기전은 아직 완전히 설명되지 않았다.실험연구를 바탕으로 타가토스에 의한 혈당농도의 조절 가능한 기전이 제안되었다.흡수 후 타가토스는 주로 간에서 대사되며 대사 경로는 과당과 동일한데, 즉, 프럭토키나제가 먼저 타가토스 1-인산염으로 인산화되고, 알돌라제가 글리세랄데히드와 디하이드록시아세톤 인산염으로 분해되며 분해율은 프럭토세스 1-인산염의 절반 정도이다.프락토스-1-인산염과 유사하게, 높아진 타가토스-1-인산염의 농도는 포도당 키나아제의 활성을 자극하여 글루코네이트-6-인산염으로의 포도당 인산화 수준이 증가하고 글리코겐 합성 효소가 더 활성화된다.동시에 타가토스 1-인산염과 프럭토세스 1-인산염은 글리코겐 인산화효소를 억제한다 [5].글리코겐 합성과 글리코겐 분열에 대한 이들 효소의 전반적인 효과는 혈당의 감소이다 (그림 1). 그림 1에서 볼 수 있듯이 과당은 혈당을 낮추는 타가토스와 비슷한 메커니즘을 가지고 있지만 [6] 타가토스가 더 효과적이며 [7] 부작용도 적다.

타가토스의 적용 3

2001년, 미국 FDA는 타가토스가 일반적으로 안전하다고 인정된다고 결정했다 (GRAS) [8].같은 해 7월 식품첨가물합동전문가위원회 (JECFA)는 타가토스를 ADI (일일섭취허용량) 가 0-80 mg/(kg•d)인 식품첨가물로 사용할 수 있는 새로운 저칼로리 감미료로 권고했다.그 후, 타가토스는 건강 음료, 요구르트, 과일 주스, 당뇨병 환자를 위한 식품, 다이어트 식품, 껌, 시리얼 식품, 육류, 사탕 등에 널리 사용되기 시작했고, 기침약, 분말, 활액제, 틀니 고정용 접착제, 구강 살균제 등에 널리 사용되기 시작했다.

2003년, 펩시콜라는 타가토스를 스프라이트 음료에 사용하기 시작했으며 이는 타가토스가 상용 제품에 사용된 최초의 사례이다.이어서, 뉴질랜드 's Miada Sports Nutrition Foods Company는 2003년 5월 호주와 뉴질랜드 시장에 출시된 초콜릿 제품에 타가토스를 사용했다.

타가토스에 대한 연구당뇨병의 치료로서 이미 시작되었다.2009년 11월 16일, Spherix는 임상 3 상이 기대했던 결과를 달성했다고 발표했다.이 회사는 2010년에 타가토스를 제2 형 당뇨병 치료에 사용하는 신약 신청서를 제출할 예정이다 [9].

4타가토스 생산

타가토스를 생산하는 방법에는 화학적 합성과 생물학적 변형의 두 가지가 있다.화학적 합성은 알칼리 조건에서 d-갈락토스로부터 타가토스의 형성을 촉진하는 촉매로 가용성 알칼리 금속염 또는 알칼리 토류 금속염을 사용하고, 금속 수산화-타가토스 복합체를 형성한 다음 산과 중화하여 d-타가토스 [10]를 얻는다.화학 방법은 에너지 집약적이고, 제품이 복잡하고, 정화가 어렵고, 많은 부반응이 있고, 화학 오염이 생성되기 때문에 생물 전환 방법은 더 나은 응용 전망을 가지고 있습니다.

현재, 더 많이 연구되고 있는 타가토스의 생산을 위한 바이오 전환 방법은 d-갈락토스의 타가토스로의 전환을 촉매하기 위해 l-아라비노스 이성질체를 사용하는 것이다.L-arabinose isomerase (EC 5.3.1.4, L-arabinose isomerase, L-AI)의 자연적인 기능은 L-arabinose 로부터 L-ribulose의 생성을 촉매하는 것이다.최근에는이 효소가 d-갈락토스를 타가토스로 전환하는 촉매도 할 수 있다는 것이 밝혀졌다.L-AI coding 유전자는 원핵생물에서 널리 발견되는데, Acidothermus cellulolyticus (Acidothermus cellulolytics) [11], Alicyclobacillus acidoc aldarius, 그 근원 AI는 AAAI 라고 한다) [12], Geobacillus stearothermophilus (GSAI) [13, 14], Thermoanaerobacter mathranii [1 5], Thermotoga maritima [16], Thermotoga neapolitana [17], Thermus sp. IM6501 [18].등이 있다.L-AI의 최적 온도 범위는 20~80 ℃ 이며, 최적 pH (pHopt)는 6.0~8.0인 것으로 확인되었다.Mn2+ 또는 Co2+와 같은 금속 이온은 안정성을 향상시킬 수 있습니다.L-AI의 산업적 생산에는 아직 개선의 여지가 많다.L-AI를 이용한 타가토스의 촉매 생산을 위한 주요 연구 방향은 아래와 같다.

4.1 효소의 촉매 활성 향상

L-arabinose의 특이활성은 약 30 U/mg 이며, L-arabinose의 특이활성은 10 U/mg 미만이다.해외에서는 효소공학을 통해 L-AI의 기질친화도와 촉매효율을 향상시키려는 초기 시도가 있었다.김 등 [19]이 임의로 변이하여 변형된 GSAI를 감독했다.1차 진화 과정에서 5개의 아미노산 부위 돌연변이가 있었고, 효소의 특정 활성은 11배 증가했습니다;2차에서는 부위 돌연변이가 3번 더 일어났고, 효소의 특이활성이 5배 더 증가했다 [20].8개의 돌연변이 부위 중 A408V와 K475N 돌연변이는 효소&에 큰 영향을 미친다#39, s 기질 친화도 및 반응 속도.최근에 연구자들은 기질로 L-arabinose 만을 사용하는 Bacillus licheniformis ATCC 14580과 B. subtilis str. 168로부터 기질 특이성이 매우 강한 두 개의 L-AI를 발견하였다 [21-22].이들의 일차서열을 다른 L-AI와 비교하고 고도화된 구조분석을 수행함으로써 L-AI의 기질특이성을 지배하는 규칙을 밝힐 수 있어 효소공학의 기초자료를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

4.2 효소의 최적 pH 감소

L-AI의 pHopt는 대부분 알칼리 범위에 있는 반면, 산업 전환은 (1) 타가토스가 pH 2-7에서 안정적이고, 높은 pH 값은 부반응을 증가시키기 때문에 산성 범위에서 더 적합합니다;(2) 유당은 보통 생산시 원료로 사용되어 유당을 가수분해하여 갈락토스를 생성하고, 갈락토스를 이성질화하여 타가토스를 만든다.유당 가수분해는 보통 산성 조건 (pH 5.0~6.0)에서 수행되며, 산성 L-AI를 사용하면 공정을 단순화하고 비용을 절감할 수 있습니다.

산성 L-AI를 얻는 첫 번째 방법은 다양한 미생물, 특히 Bacillus acidopullulyticus (pH opt 6.0, 65 ° C, ATCC 43030) [12]와 같은 산성 미생물을 걸러내는 것이다.또한 pHopt 가 중성 범위에 속하지만 산성조건에서도 대부분의 활성을 유지하고 일정한 안정성을 유지할 수 있는 L-AI 가 있는데, Acidithiobacillus ferrooxidans [11]에서 유래한 L-AI 가 있다.

산성 L-AI를 얻는 또 다른 방법은 효소공학이다.리등 (12, 23)은 AAAI (pHopt = 6), GSAI (pHopt = 7) 및 BHAI (B. halodurans, pHopt = 8)의 아미노산 서열을 비교하고 269개의 lysine 잔기가 AAAI의 산 적응을 담당하는 것으로 판단됨을 제안하였다.이후 site-directed mutagenesis를 통해이 가설을 확인하였는데, AAAI-K269E의 pHopt는 알칼리 범위로 한 단위 이동하였고, BHAI-E268K의 pHopt는 산성 범위로 한 단위 이동하였다.Oh 등 [24]은 다른 GSAI (pHopt = 8.5)의 Val408과 Asn475에 대해 site-directed random mutagenesis를 수행하여 pHopt 가 7.5인 Q408V와 R408V인 두 돌연변이를 얻었다.최근에는 Rhimi 등 [25]이 B. stearothermophilus US100 으로부터 L-AI (BSAI)를 이성적으로 조작하였다.한가지 돌연변이체인 Q268K는 야생형 효소보다 내산성이 우수하였으며, 이는 Lee 등의 결과와 일치하였다.L-AI의 최적 pH의 변화는 하나 이상의 아미노산 부위를 돌연변이시킴으로써 이루어질 수 있음을 알 수 있다.현재, pHopt에 영향을 미치는 아미노산 부위는 Lys269 (AAAI, BHAI의 Glu268 및 BSAI의 Gln268에 대응) 및 Val408 (GSAI)를 포함 하는 것을 확인 할 수 있습니다.상기 두 부위의 이중 돌연변이와 pHopt에 영향을 미치는 다른 아미노산 부위의 확인은 향후 L-AI의 추가적인 산성화를 위한 가능한 경로이다.

4.3 금속 이온 독립적인 열 안정성 달성

반응 온도는 갈락토스 이성화 반응에 상당한 영향을 미친다.온도가 증가함에 따라 갈락토스에 대한 L-AI의 결합 반응 능력이 증가하며, 반응 속도가 가속화되고, 평형점이 생성물 쪽으로 이동하며, 전환율이 크게 증가한다.그러나 80 °C보다 높은 온도는 갈색으로 변하게 되므로 산업 생산에 적합한 반응 온도는 60~70 °C이다.T. mathranii[15], G. stearothermophilus[23], G. thermodenitrificans[26], B. stearothermophilus US100[13]및 Thertmus sp.[18]와 같은 일부 열성 또는 극열성 박테리아들이 클로닝 되어 최적의 반응 온도와 우수한 열 안정성을 가진 L-AI로 확인되었다.

그러나 이러한 L-AI는 열적 안정성을 유지하기 위해 금속 이온에 의존한다.반응 중에 첨가된 금속 이온이 생성물에서 제거되어야 하기 때문에, 이것은 비용을 추가하고 오염을 발생시킨다.따라서 금속이온에 독립적인 열적으로 안정한 L-AI 가 필요하다.B. stearothermophilus US100 으로부터 L-AI는 65 °C 이하에서는 금속이온 독립적이며 65 °C 이상의 효소 활성을 유지하기 위해서는 Mn2+ 가 필요하지 않으나 안정성은 영향을 받는다.단백질의 열적 안정성을 유지하기 위해서는 0.2 mmol/L Co2+와 1 mmol/L Mn2+ 만이 필요하다 [13].추가적인 돌연변이와 스크리닝을 통해 금속 이온으로부터 완전히 독립적인 L-AI를 얻을 수 있다.

또한 대장균으로부터 추출한 L-AI의 결정구조가 규명되었으며 [27], 다양한 원천으로부터 추출한 L-AI의 3차원 구조를 분자 시뮬레이션을 통해 구성할 수 있어 효소공학 연구의 이론적 기반을 제공할 것이다.

효소 조제의 생산 및 고정화 4.4

현재 L-AI의 이형발현은 대부분 대장균에서 이루어진다.그러나 타가토스는 식품과 의약품에 사용되기 때문에 식품에 안전하지 않은 미생물에서 발현되면 안전성에 문제가 있을 수 있다.따라서 산업 생산 응용 분야에 적합한 L-AI를 얻기 위해 효소의 엔지니어링 후 다음 단계는 식품 안전 미생물에서 발현하는 것입니다.일반적으로 식품에 안전한 미생물로 사용되는 것으로는 바실러스, 코리네박테리움, 효모 등이 있다.

L-AI 발현이 높은 조작된 세균을 얻은 후 고정화 효소 또는 고정화 세포를 이용하여 바이오촉매를 제조할 수 있다.현재 L-AI 효소 조제를 고정화하는 데에는 염화나트륨-알긴산-칼슘법이 대부분 사용되고 있다.그러나 현재 공업에서 성공적으로 사용되고있는 고정화효소와 고정화세포의 방법을 차용하면 효률을 더욱 높이고 반감기를 증가하며 원가를 절감할수 있다.

5 전망

Tagatose수십 년 동안 발견되었으며, 외국 연구자들은 그것의 물리적, 화학적 성질과 생리적 기능에 대해 비교적 철저한 연구를 수행했다.많은 국가에서 제품 생산에 식품 및 의약품 첨가제로 사용되고 있으며 관련 표준과 법규가 제정되어 있다.비즈니스컨설팅 (BBC)은 타가토스의 시장 점유율이 뚜렷한 상승세를 보일 것으로 전망했다.중국에서는 타가토스에 대한 연구가 거의 이루어지지 않았고, 최근에서야 관련 연구가 이루어지고 있다.타가토스의 산업 생산 및 응용은 아직 보고되지 않았으며, 타가토스 소비 시장은 여전히 공백이다.따라서 타가토스의 국내 생산 및 응용에 대한 잠재력이 매우 크며, 국내 연구진에 의한 개발을 기다리고 있다.

참조

[1] Normen L, Laerke H N, Jensen B B 외.D-tagatose의 소장 흡수와 탄수화물 소화율에 대한 관련 효과:ileostomy 연구.Am J Clin Nutr, 2001, 73(1):105-110.

[2] Donner TW, Wilber J F, Ostrowski D. D-tagatose, a novel hexose:acute effects on carbohydrate tolerance in subjects with and without type 2 당뇨병 [J].당뇨병 Obes Metab, 1999, 1(5):285-291.

[3]Wong D. 감미료는 약물, 구강청결제, 치약 등에서 안전하다고 판단되었다 [J.덴트 투데이, 2000, 19(5):32, 34-35.

[4] 레빈 G V. 타가토스의 주요 혈액 인자 강화 사용:US, 6015793[P].2000-01-18다.

[5] 에르칸 팡엔, 가논 M C, 라스 V L 등.다중 변조제의 인간 간 글리코겐 인산효소 a에 대한 통합 효과 (Integrated effects of multiple modulators on human liver glycogen phosphorylase a[J])Am JPhysiolEndocrinol Metab, 2002, 283(1):E29-37.

[6]Buemann B, Toubro S, Holst J J 외.d-과당의 입체 이성질체인 d-타가토스는 혈중 요산 농도를 증가시킨다 [J].신진대사, 2000, 49(8):969-976.

[7] 미국 당뇨병 협회.당뇨병 및 관련 합병증의 치료와 예방을 위한 근거 기반 영양 원칙 및 권장 사항.당뇨관리, 2002, 25(1):202-212.

[8] 식약청, HHS.우리,이다.식품 표시:건강 주장;d-타가토스와 충치.마지막 규칙 [J]이다.Fed Regist, 2003, 68(128):39831-39833.

[9] Spherix,어 주세요.[우리] D-tagatose 합니다.[2010-03-18]다.http://www다.바이오구체 (http://biospherics.com/biospherics_d-tagatose.html)

[10] Beadle J R, Saunders J P, Wajda Jr. T J. 제조 공정:US, 5078796[P].1992-01-07다.

[11] 청 L, 무 W, 장 T, 외.An L-arabinose isomerase from Acidothermus cellulolytics ATCC 43068:cloning, expression, purification, and characterization[J] (연구논문)2009년 Appl Microbiol Biotechnol.

[12] Lee  S  J, 이승우 (Lee D W),Choe E A, 외.Alicyclobacillus acidocaldarius에서 Lys-269의 역할 (a thermoacidophilic L-arabinose isomerase from Alicyclobacillus acidocaldarius:role of Lys-269 in pH optimum[J])Appl Environ Microbiol, 2005, 71(12):7888-7896.

[13]  Rhimi M, 베자르 Bacillus stearothermophilus US100 균주로부터 금속이온 독립적이고 열활성 l-arabinose 이성질체의 S. 클로닝, 정제 및 생화학적 특성 (J., Biochim Biophys Acta, 2006, 1760(2):191-199.

[14] 를 포함하는 고정화 재조합 대장균 세포에 의한 Jung E S, 김H J, Oh D K. Tagatose 생산 packed-bed 생물반응기에서 Geobacillus stearothermophilus L-arabinose isomerase 돌연변이 (J.Biotechnol Prog, 2005, 21(4):1335-1340.

[15] Jorgensen F, Hansen O C, Stougaard P. Enzymatic conversion of D-galactose to D-tagatose:heterologous expression and characterisation of a thermostable L-arabinose isomerase from Thermoanaerobacter mathranii[J] (공저).Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64(6):816-822.

[16] Lee D W,  장형재 (Jang H J), 최이아 (Choe E A) 외연구논문:hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima 로부터 thermostable L-arabinose (D-galactose) 이성질체의 특성 (characteristics of thermostable L-arabinose (D-galactose) isomerase from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima[J])Appl Environ Microbiol, 2004, 70(3):1397-1404.

[17] 김 씨는 B C, Lee Y H, Lee H S 등.L-arabinose isomerase의 Cloning, expression and characterization of L-arabinose isomerase from Thermotoga neapolitana:효소 [J]를 이용한 d-갈락토스의 d-타가토스로의 생물전환.FEMS MicrobiolLett, 2002, 212(1):121-126.

[18]  Kim J W, Kim Y W, Roh H J, 외.Thermus sp. IM6501[J] 로부터 재조합 thermostable L-arabinose isomerase에 의한 tagatose 생산.BiotechnolLett, 2003, 25(12):963-967.

[19] 김 P, 윤 S H, 서엠제이 (Seo M J) 외.열안정 갈락토스 이성질화효소의 유전적 진화에 의한 타가토스 전환율 향상 [J].BiotechnolAppl Biochem, 2001, 34(Pt 2):99-102.

[20]Oh H J, Kim H J, Oh D K. Geobacillus thermodenitrificans[J] 로부터 L-arabinose isomerase의 site-directed mutagenesis에 의한 D-tagatose 생산속도의 증가.Biotechnol Lett, 2006, 28(3):145-149.

[21] Kim  J-H, Prabhu P, Jeya M, 외.Bacillus subtilis[J] 로부터 L-arabinose isomerase의 특성 (characteristics of an L-arabinose isomerase from Bacillus subtilis[J])Appl MicrobBiot, 2009, 85(6):1839-1847.

[22] 프라부 P, 티와리 엠 K, 제야 엠 외.Bacillus licheniformis[J]의 Cloning 및 특성 (a novel L-arabinose isomerase from Bacillus licheniformis[J])Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 81(2):283-290.

[23] Lee D W, Choe E A, Kim S B, 외.mesophilic Bacillus halodurans와 thermophilic Geobacillus stearothermophilus의 L-arabinose 이성질체에서 촉매 및 구조적 기능에 대한 뚜렷한 금속 의존성 (Distinct metal dependence for catalytic and structural functions in the L-arabinose isomerases from the mesophilic Bacillus halodurans and the thermophilic Geobacillus stearothermophilus)Arch Biochem Biophys, 2005, 434(2):333-343.

[24]Oh D K, Oh H J, Kim H J 등.D-galactose 이성질화를 위한 Geobacillus stearothermophilus의 L-arabinose 이성질화효소로부터 최적 pH의 수정 (Modification of 최적 pH in L-arabinose isomerase from Geobacillus stearothermophilus for D-galactose isomerization[J.J Mol Catal B-Enzym, 2006, 43(1-4):108-112.

[25] 려미름, 아가자리엔, 주이름 외.Bacillus stearothermophilus US100 L-arabinose isomerase의 합리적 설계:D-tagatose 생산을 위한 잠재적 응용 [J].바이오치미, 2009, 91(5):650-653.

[26] 김 H J, D-tagatose를 생산하는 Geobacillus thermodenitrificans 분리한 균주로부터 L-arabinose isomerase의 Oh D K. 정제 및 특성 (J.J Biotechnol, 2005, 120(2):162-173.

[27] 생물학적 타가토스 생산의 추정 목표인 Escherichia coli L-arabinose isomerase (ECAI)의 Manjasetty B A, Chance M R. 결정 구조 [J].J Mol Biol, 2006, 360(2):297-309.