페룰산에서 천연 바닐린을 얻는 방법은?

Abstract:바닐린은 세계에서 세 번째로 큰 식용 향신료이며, 피플 &의 개량과 함께#39;의 건강 의식, 천연 바닐린의 복용량은 해마다 증가하고 있습니다.본 논문에서는 바닐린 생산을 위한 발효균으로 Streptomyces psammoticus OMK-4를 사용하였으며, 30-L 자동보충발효기에서 발효조건을 맵핑하여 최적화하였다.inoculum 양, 배양온도, 배양 pH, 용존산소 및 기타 발효조건의 최적화를 통해 최적의 발효조건을 결정하였으며, 그 효능은 25.3 g/L로 높게 나타났다.그 결과는 다음과 같았다.

과학적으로 4-하이드록시-3-메톡시 벤즈알데히드로 알려진 바닐린 (Vanillin)은 페루의 발삼, 클로브 버드 오일, 바닐라, 커피, 포도, 브랜디 등에 함유되어 있으며 바닐라 냄새와 달콤한 맛을 가지고 있다 [1-3].바닐린은 식품, 담배, 화장품, 농업 등에서 아로마 증진제, 조미료, 조화제, 아로마 촉진제 등으로 사용될 수 있는 중요한 향미이다.  응용범위가 넓기때문에 바닐린의 년간수요는 10%의 속도로 장성하고있으나 국내생산량으로는 아직 국내외 시장수요를 충족시키지 못하고있다 [4-5].

바닐린은 화학적 합성, 추출, 생물 변환 및 효소적 방법 [6]으로 생산할 수 있다.피플 &의 증가로#39;의 건강 의식, 천연 바닐린의 수요와 가격이 지속적으로 상승하고 있으며, 최근 뜨거운 연구 주제가 되고 있다 [7].그러나 식물에서 추출한 제한된 천연바닐린은 시장수요를 충족시키기에는 거리가 멀고 화학합성으로 인한 환경부담도 갈수록 가중되고있어 생물전환과 효소방법이 바닐린생산에서 주역으로 되였다 [8-9].

본 논문은에 대한 생물 변환 방법을 채택한다미생물 대사를 통해 바닐린을 생산합니다주기가 짧고 수율이 높고 오염이 적은 ferulic acid를 기질로하고 발효 조건을 최적화한 후에는 산업화의 조건이 가능하다.

재료 및 방법 1

1.1시험계통

스트렙토마이세스 psammoticus OMK-4를 샤먼 오미크론 바이오테크놀로지 (Xiamen Omicron Biotechnology Co.)의 균주실에 증착하였다.

1.2주요기구

30 L 자동 리필 발효기, 상하이 Baoxing Biotechnology Co., Ltd;고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 애 질 런 트, 1260년 Ⅱ;바이오센서, 산동과학원, SBA-40E;분광광도계, Shimadzu, UV-1780;pH 미터, 메틀러, S-210S.

1.3문화 미디어

1.3.1시드 미디어

가용성 전분 1.0~3.5 g/L, 인산이 수소 칼륨 0.1~0.5 g/L, 요소 0.1~0.3 g/L, 황산마그네슘 0.05~0.10 g/L, 탄산칼슘 0.1~0.3 g/L, 효모 침지 분말 0.1~1.0 g/L, 물엿 0.1~1.0 g/L, 황산암모늄 0.1~0.6 g/L, 페룰산 0.2 g/L.

1.3.2발효 매체

가용성 전분 2.0~5.0 g/L, 인산이수소 칼륨 0.1~0.3 g/L, 요소 0.1~0.5 g/L, 황산마그네슘 0.05~0.1 g/L, 탄산칼슘 0.5~2.0 g/L, 효모 추출물 0.1~1.0 g/L, 황산암모늄 0.1~0.5 g/L, 아빅산 2.0 g/L.다음은 시료 제조에 사용된 가용성 전분의 몇 가지 예입니다.

1.4 재배 방법

1.4.1 종자배양

무균조건에서 접종주걱을 이용하여 배양된 고체경사에서 잘 자란 균주를 full ring으로 무균종자 매질에 삽입하였고, 종자 매질의 초기 pH는 5~8 이었으며, 배양온도 28~35 ℃, 회전속도 200~500 r/min의 조건에서 유기체를 로그성장단계까지 배양하였다.

1.4.2발효배양

로그 성장 단계까지 배양된 종자액을 무균 조건에서 5%~15% 부피의 발효 매체에 첨가하였다;발효 중간의 초기 pH는 7. 2~7. 8,과 70~120에 대한 발효 수행 되었h의 온도 조건 밑에 30~40 ℃, 배출 해 200~500 r/min의 속도와 탈취 상 1 ︰ 0. 5의 비율 입니다.1의 발효 조건 밑에 수행 되었︰ 0. 5, 그리고 발효 1 ︰ 0. 5의 조건 아래에서 수행 되었다.

발효조건의 최적화 1.5

바닐린 발효에 pH 1.5.1 효과

발효과정의 pH는 기질의 존재에 영향을 미칠 뿐만 아니라 세포의 삼투압과도 상관이 있어 기질이 세포 안으로 들어가고 나가는 데에도 영향을 미친다.최적의 발효 pH를 구하기 위하여 다양한 pH 조절이 바닐린의 효능에 미치는 영향을 조사하였으며, 구체적인 방법은 다음과 같다:(1) 발효 전 과정의 pH는 7.5로 조절되었다;(2) 발효 공정의 pH는 0-12 h 동안 7.5로 조절한 후, 이후 발효 공정의 pH는 8.0으로 조절하였다;

(3) pH는 발효과정 내내 8.0으로 조절되었다.

에 대한 용존산소의 효과 1.5.2vanillin 발효

실험결과 발효국물 내 용존산소의 조절은 후기의 균생장 및 산물의 축적에 큰 영향을 미치므로 발효과정에서 용존산소를 조절하는 것이 필요하다.발효시 용존산소의 최적 조절효과를 얻기 위하여 다양한 용존산소 조절효과가 세균의 성장과 산물의 축적에 미치는 영향을 조사하였다.다음과 같은 실험을 수행하였다:용존산소의 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%는 각각 회전속도와 기공에 의해 조절되었다.

배양온도가 바닐린 발효에 미치는 영향 1.5.3

온도는 미생물의 생산, 대사산물의 합성과 축적에 중요한 영향을 미친다.온도가 높아지면 미생물의 생장과 신진대사를 가속화할수 있지만 온도가 너무 높으면 유기체의 조기쇠퇴를 초래하고 생산물의 축적에도 영향을 주게 된다.따라서 변형 [10]의 온도를 최적화하는 것이 중요하다.최적의 발효배양온도를 구하기 위해 다양한 배양온도가 균성장에 미치는 영향을 조사하였고, 최적의 온도조절방법을 얻기 위해 25 ℃, 30 ℃, 35 ℃, 40 ℃로 온도를 조절하여 균생장과 바닐린의 축적량을 비교하였다. 

inoculum 양이 바닐린 발효에 미치는 효과 1.5.4

서로 다른 inoculum 양은 박테리아의 정상적인 성장과 대사에 중요한 영향을 미치며, 너무 적은 inoculum은 박테리아의 성장을 느리게하고, 박테리아의 성장 지연 기간이 길어지며, 2차 대사 산물의 복잡성은 후기 산물의 축적에 도움이되지 않습니다;이노쿨럼이 너무 많으면 세균이 과잉 증식하게 되고, 매질은 영양소 소모량을 증가시키고, 용존산소는 조절 요구량을 맞출 수 없게 된다 [11].따라서 발효inoculum의 양을 조절하는 것이 중요하다.최적 발효 inoculum 수준을 얻기 위하여 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하였으며, 균주의 생육과 바닐린의 축적을 1%, 3%, 5%, 7%, 9%의 5가지 그래디언트별로 비교하여 최적 발효 inoculum 수준을 얻었다.

1.6분석의 방법

세균의 농도 측정:배양액을 취하여 증류수로 일정 횟수 희석시킨 후 잘 섞어 분광광도계를 이용하여 620nm 에서의 흡광도를 측정한다.

잔류 설탕 결정:페린 's 시약적정이 사용되었다 [12].바닐린 함량 측정:HPLC [13].

결과 및 논의 2

바닐린 발효에 pH 가 미치는 영향 2.1

도 1에 나타낸 바와 같이, pH 7.5에서 세균의 성장이 더 좋았으며, 최대 OD620은 0.62;세균의 성장은 pH 8.0에서 더 심하였으며, 최대 OD620이 0.41;그리고 세균의 성장은 0-12 h 동안 pH 7.5에서 더 잘 성장하였으며, 이후 8.0의 대조구에서는 최대 OD620이 0.64로 나타났다.따라서 pH 7.5 까지는 세균의 성장이 촉진되었고, pH 가 높을 때는 세균의 성장이 느려졌다.pH 가 높을수록 세균의 성장이 느려진다.세분화된 pH 조절로부터 후기 단계에서 pH를 8.0으로 조절하였을 때 균주의 성장은 영향을 받지 않아 균주는 발효 약 12시간에 기본적으로 안정화 단계에 도달하였음을 알 수 있다.

도 2를 보면, pH 조절에 따라 바닐린 농도가 13.200 g/L, 16.988 g/L 및 14.500 g/L 이었고, 바닐린 전환율은 0~12시간까지 pH 7.5에서 가장 높았고, 그 다음으로 pH 8.0에서 더 나빴으며, pH 7.5에서 더 나빴던 것은 pH 8.0에서 효소활성이 pH 7.5보다 좋았기 때문인 것을 알 수 있다.이는 pH 8.0에서의 효소활성이 pH 7.5에서의 효소활성에 비해 더 좋았기 때문인 것으로 사료된다.

그림 1과 2를 종합한 결과, pH 7.5에서 세균의 생장이 더 좋았으며, pH 8.0에서 효소전환율이 더 높았다고 요약할 수 있다.따라서 발효 중 분획제어가 세균의 성장에 도움을 주고보다 나은 효소활성을 얻을 수 있을 것으로 판단되어 선정하였다.

바닐린 발효에 대한 용존산소의 효과 2.2

도 3에서 볼 수 있듯이 용존산소가 증가함에 따라 박테리아의 농도가 증가하고 있었는데, 박테리아의 성장이 용존산소 0%에서 가장 나빴고, 기본적으로 박테리아의 성장은 없었다;용존산소의 40%~50%에서 박테리아의 최적 생장조건이었고, 박테리아의 생장이 가장 높았으며, OD620은 0.75 이었다.용존산소가 증가하는 경우 세균이 로그성장기에 진입하는 시간은 점차 감소하며, 용존산소가 40%~50%에 도달하면 세균의 성장을 위한 적응기간이 가장 짧고, 세균이 로그성장기에 빠르게 진입할 수 있어 발효주기를 단축시킬 수 있다.따라서 세균의 성장을 위해서는 많은 양의 산소공급이 필요하며, 용존산소량이 40%~50% 일 때 세균의 성장이 가장 좋다고 판단할 수 있다.

도 4에서, 바닐린의 축적은 점차적으로 증가하다가 용존산소의 증가에 따라 서서히 감소하는 것을 알 수 있으며, 가장 좋은 바닐린의 축적은 용존산소의 약 30%에서 발견되었고, 가장 높은 축적은 약 17.5 g/L 이었다.낮은 용존 산소에서 바닐린의 낮은 축적은 박테리아의 생산 불량, 불충분한 효소 또는 낮은 용존 산소 조건이 효소 활력에 영향을 미치기 때문일 수 있습니다.용존산소가 점차 증가함에 따라 바닐린의 축적은 점차 감소하는 경향을 보였으며, 특히 용존산소 50% 에서는 발효 후기에 바닐린의 감소가 발생하였고, 부산물로 바닐린의 축적이 점차 증가하는 것으로 확인되었는데, 이는 바닐산의 생성에 편중된 신진대사 흐름을 초래하는 과도한 용존산소 때문인 것으로 의심되었다.용존산소 농도가 너무 높아 대사 흐름이 바닐린 생성 쪽으로 치우치는 것이 아닌가 의심된다.따라서 전체 전환율에 영향을 미치지 않도록 바닐린 생산 단계에서 용존 산소 수준이 너무 높아서는 안 됩니다.

무화과 3, 4에서 알 수 있듯이 발효과정에서의 용존산소의 조절은 단계별로 조절할 수 있는 것으로 선정하였는데, 용존산소는 세균의 부피축적 및 세균의 성장주기 단축을 위해 세균생장단계에서 40%~50%로 조절하였고, 생성물의 빠른 축적을 위해 바닐린 생성단계에서 30%로 조절하였다.

배양온도가 바닐린 발효에 미치는 영향 2.3

도 5에서 온도가 낮을 때 세균의 성장이 느렸고, 배양온도가 증가함에 따라 세균의 농도가 점점 높아짐을 알 수 있으며, 온도가 약 35 ℃에 도달했을 때 세균의 농도가 가장 높았으며, OD620은 0.73;그러나 세균의 농도는 온도가 40 ℃로 증가함에 따라 감소하기 시작하였는데, 이는 고온에 의해 세균의 정상적인 대사가 파괴되었기 때문으로 추정된다.

도 6에서 볼 수 있듯이 온도가 점차 증가함에 따라 바닐린의 전환율은 점점 더 높아졌으며 전환 효과는 크기 순으로 35 ℃, 30 ℃, 40 ℃, 25 ℃;각 세균의 전환율을 계산한 결과 최적 온도는 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃, 25 ℃의 크기순으로 나타났다.최적 온도는 40 ℃, 35 ℃, 30 ℃, 25 ℃였다.온도가 점차 증가함에 따라 바닐린의 전환율이 점점 높아짐을 알 수 있으며, 온도가 높은 바닐린의 전환율이 낮은 바닐린보다 좋음을 알 수 있다.

그림 5와 6을 비교해 보면, OMK-4 균주의 발효 및 바닐린 전환에 온도의 영향이 더 컸음을 알 수 있으며, 균주의 배양 및 바닐린의 전환에 35 ℃의 온도가 선택되었다.

inoculum 양이 바닐린 발효에 미치는 영향 2.4

그림 7에서 우리는 부동한 접종량이 최종 세균의 농도에 미치는 영향을 볼수 있는데 5가지 부동한 접종량은 약 0.7의 농도에 도달할수 있으며 그중 1%의 접종량이 더 나쁜 영향을 주는데 가장 높은 농도는 약 0.65 밖에 안된다.  균주량의 증가에 따라 발효 지연기간이 단축된 첫 10 h 에서는 1% 및 9%와 비교하여 지연기간이 약 6시간 분명히 단축되었으며, Fig. 8에서 9%의 inoculum이 1%의 inoculum보다 더 효과적임을 알 수 있다.Fig. 8에서 9%의 inoculum 양이 다른 4 종의 inoculum 양에 비해 확실히 불량하였음을 알 수 있는데, 이는 배양과정에서 주로 균이 공급되어 균주의 농도가 증가함에 따라 효소활력이 저하되기 때문으로 추정된다.그러므로 접종과정에 접종량이 너무 많아서는 안된다.1%, 3%, 5%, 7%의 접종량을 비교한 결과 바닐린의 전환율은 다른 네 가지 접종량보다 약간 높았으며 가장 높은 전환량은 17.21 g/L, 17.23 g/L, 18.05 g/L, 17.27 g/L 이었다.무화과 7과 8의 결과를 고려하여 최적 inoculum 양 5%를 최종 선발하였다.

3 결론

30L 자동충전 발효기의 최적화를 통해 얻어진 최적 발효조건은 0~12시간에서 pH 7.5 및 용존산소 40%~50%, 그리고 pH 8.0 및 용존산소 30%;발효온도는 발효 내내 35 ℃ 였으며, inoculum 양은 5% 이었다.발효온도는 35 ℃ 였고, inoculum 양은 5%였다.36시간 동안 최적조건에서 발효를 수행하였으며, 최종 바닐린의 효능은 25.3 g/L로 높게 나타나 pilot 실험에서 좋은 결과였다.

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