발효법으로 감미료 자일리톨 분말을 생산하는 방법?

1 도입

자일리톨은 식품, 의약 및 기타 영역의 분야에서 넓은 시장 공간을 가지고 있으며 [1-3] 발전 가능성이 크다.현재, 생체 분해를 통한 자일리톨 생산은 자일리톨을 생산하는 새로운 친환경적이고 경제적인 방법입니다.바이오침전에 의한 자일리톨의 생산은 격렬한 화학반응을 피하고, 고온, 고압의 장비와 촉매를 필요로 하지 않으며, 균주의 특이성, 효소의 특이성, 전환 및 다른 특성의 독특성으로 인하여, 바이오침전에 의한 자일리톨의 생산은 환경보호, 에너지 절약, 고효율 및 다른 많은 장점을 가지고 있으며, 산업 발전의 큰 잠재력을 가지고 있다,국내외 연구자들 [4,5]에 의해 널리 연구되고 관심을 받고 있는 것.

비록미생물 발효에 의한 자일리톨 생산광범위한 개발 및 응용 가능성을 가지고 있으며, 실제 연구 및 산업화 중에 해결해야 할 많은 문제:고성능 발효 균주를 얻는 방법, 종합 발효 제어를 통해 생산량을 안정화하고 향상시키는 방법, 산업화 과정을 더욱 촉진하는 방법 [6]등이 아직 많이 있습니다.따라서 현재 미생물 발효에 의한 자일리톨 생산에 대한 연구는 다양한 자일리톨 생산 균주의 발효 성능, 발효 기질로서 식물 헤미셀룰로오스 가수분해물의 제조, 해독 및 발효 조건, 그리고 고정화 기술을 이용하여 다회분 발효를 위한 연구 [7]가 있다.본 논문에서는 바이오프로세싱에 의한 자일리톨 생산에 관한 주요 연구 성과를 중심으로 살펴보고자 한다.

발효에 의한 자일리톨 생산을 위한 미생물 2

2.1 천연 미생물에 의한 자일리톨의 발효

공업발효생산에서 균주의 발효성과는 미생물대사의 생산능력, 발효생산비용, 공업규모생산의 곤난과 직접 관계된다.현재 자일로스/자일리톨 전환 및 자일리톨 수율은 여전히 미생물 전환에 의한 자일리톨 생산의 규모화를 제한하는 병목 중 하나이므로 [8]성능이 우수한 고수익 자일리톨 균주를 얻는 것이 특히 중요하다.

자일로스를 이용하여 다양한 대사 경로를 통해 자일리톨을 생산할 수 있는 미생물은 많은 종이 있으며, 소수의 박테리아, 일부 곰팡이, 대부분의 효모 [2]등이 있다.그러나 대부분의 미생물은 발효에 의해 낮은 전환율로 자일리톨을 생성하는 것으로 보고되었다.균류는 자일로스 → 자일룰로스 → 자일리톨 경로를 통해 자일리톨을 생산할 수 있지만, 일반적으로 균류의 생산 효율은 낮다 [9].종합적인 분석을 통해 효모, 특히 Pseudomallei 가 자일리톨 발효에서 우수한 성능을 가지고 있으며, 최대 수율은 이론치의 84.5%에 달할 수 있다는 것이 밝혀지고 있어 현재 대부분의 국내외 연구는 효모를 이용하여 자일리로스를 전환하여 자일리톨을 생산하는 것에 초점을 두고 있다 [10,11].

발효에 의한 자일리톨 생산을 위한 유전자 조작 균주의 제작 2.2

최근 유전공학기술이 급속히 발전함에 따라 일부 연구자들은 자연으로부터 선별, 복제, 형질전환 수단을 통해 높은 수확량을 얻는 균주를 얻었다.대장균은 규제가 쉽고, 재배가 용이하며, 대사 배경 [12]이 명확하다는 장점 때문에 자일리톨 생산을 위한 유전자 조작 박테리아의 첫 선택으로 간주된다.xylosereductase유전자를 대장균 세포에 도입하여 발효 후 자일리톨을 검출할 수 있음이 입증되었다.그러나, 대장균에 도입 된 자일로스 환원 효소만이 자일로스 환원 효소 (XR) 특이성이 상대적으로 나쁜 것과 같은 특정 결함을 여전히 가지고, 자일로스와 아라비노스 전환을 모두 촉매할 수 있습니다.아라비노스로부터 생성된 아라비니톨과 자일리톨은 미분 이성질체이며, 둘다 물리화학적 성질이 극히 유사하여 [13]이후의 분리 및 정제에 어려움이 커진다.따라서 일부 연구자들은 자일로스 이성질화효소 유전자와 자일리톨 환원효소 유전자를 대장균에 도입하였고, 자일로스 전환의 중간생성물로 자일룰로스를 이용하여 자일리톨을 생산하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 자일로스 대사 경로는 자일로스가 자일로스 이성화효소 (XI)에 의해 자일로스로 이성화된 후, 자일리톨 환원효소에 의해 자일리톨이 생성되는 것을 알 수 있다.이 경로의 건설은 자 일리 톨생산 [14]을위한 새로운 경로인 XR 촉매 비 특이성 문제를 효과적으로 피할 수 있습니다.또한 L-arabinose 이성질화 효소 유전자, alloxanose 이성질화 효소 유전자 및 xylulose reductase유전자를 대장균에 도입함으로써 L-arabinose에서 자일리톨로의 새로운 대사 경로를 구축하였을 뿐만 아니라, arabinitol의 간섭도 제거하여 [15]대장균에 매우 유리하다.왕Xiaoxi한등 [16]은 xylanase 유전자 (xynA)와 xylosereductase 유전자 (xyl1)를 Escherichi한coli로 유도하여 공동발현을 유도한 결과 두 효소의 효소활성이 분리발현의 효소활성에 비해 낮지만, 발효에 의한 자일리톨 제조를 위한 리그노셀룰로오스 원료로부터 직접 추출할 수 있음이 증명되었으며, 헤미셀룰로오스 가수분해물로부터 추출할 필요는 없으며,크실리톨 바이오 공정의 생산을 위해 열어주는 새로운 경로이기도 합니다.이것은 또한 자일리톨의 생물학적 생산을 위한 새로운 길을 열어 줍니다.

현재는 대장균뿐만 아니라 유전공학세균의 운반체로 이용되고 있으며, 효모균도 중요한 산업미생물로 사용되는 경우가 많다.Saccharomycescerevisiae는 일부 성장 억제제에 대한 내성이 높고 성장이 빠르며 부산물이 적으므로 유전공학 벡터의 핵심 연구 대상 중 하나이다 [17,18].그림 1에 나타낸 바와 같이 효모세포의 자일로스 대사는 자일로스 환원효소에 의해 촉매된다.그러나 Saccharomycescerevisiae는 자일로스와 관련된 효소의 부족으로 자연 상태에서는 자일로스를 이용하지 못하고 [19]포도당을 탄소와 성장 및 대사에 필요한 에너지원으로만 사용할 수 있다.따라서, Saccharomyces cerevisiae에 xylosereductase 유전자 (xyl1)의 도입 및 효율적인 발현 확보는 자일리톨 생산 균주 제조를 위한 첫 번째 전제 조건이다.

리 등 (20)은 Saccharomyces cerevisiae의 자일로스환원효소 유전자를 사카로마이세스 세르비지애 (Saccharomyces cerevisiae)에 도입하여 자일로스환원효소 (xylosereductase) 유전자의 높은 copy를 포함하는 재조합 사카로마이세스 세르비지애 균주 XGH2를 얻었으며, 이를 통해 자일로스환원효소 활성을 초기 균주에 비해 80배 증가시켰다.그리고 재조합 균주의 자일리톨 탈수소효소의 부족으로 인해이 재조합 균주의 자일로스 전환율은 1.0 g/g 이상으로 산업화 가능성이 크다.

헤미셀룰로오스 가수분해물의 발효에 의한 자일리톨 생산 3

의 원료로 순수한 자일로스를 사용합니다자일리톨 (xylitol) 생산생물학적 방법에 의하여 크실리톨의 응용 분야 및 시장 공간을 제한하는 높은 생산 비용이 있습니다.자연에서 옥수수콘, 배가스, 목화씨 선체 등의 식물섬유에는 자일로스가 다량 함유되어 있어 가수분해되어 자일리톨 생산을 위한 발효기질로 이용될 수 있다 [21,22].순수 자일로스를 대량으로 존재하고 원료로 지속가능하게 재생될 수 있는 식물섬유로 대체하면 생산비용을 효과적으로 절감하고 천연자원의 완전한 이용을 실현할 수 있다.

3.1 헤미셀룰로오스 가수분해물의 제조

생물학적 방법으로 크실리톨 생산의 산업화를 촉진하기 위해서는 고품질 및 효율적인 가수분해 방법을 찾는 것이 매우 필요합니다.헤미셀룰로오스 가수분해물의 제조에는 주로 화학적방법과 효소방법 두가지가 있다.화학적 방법 [23]에서 묽은 황산과 염산이 촉매로 흔히 사용된다.묽은 산을 사용하면 강산성 조건에서 가수분해에 비해 독성물질의 함량을 줄일 수 있지만 발효 국물에 비발효성 올리고당이 다량 남아 있어 낭비가 크다.동시에 묽은 산 가수분해는 여전히 효모세포의 성장과 자일로스의 전환을 억제하여 자일리톨의 수율이 낮아지고 잔당의 농도가 높아진다 [24].

산 가수분해의 부작용을 줄이기 위해 기계적인 방법을 사용하여 완화할 수 있는데, 예를 들어 정선홍 등 [21]은 초음파와 산을 이용하여 대기압에서 차씨선체를 가수분해하여 자일로스를 준비하고, 소량의 산을 사용하여 높은 자일로스 농도를 얻었다.또한, 효소발효에 의해 생성된 자일리톨의 발효능은 순수 자일리로스에 비해서는 좋지 않지만 산가수분해발효 [25]에 비해서는 현저히 우수한 것으로 나타났다.

옥수수 알맹이의 경우, 알맹이를 가수분해하기 위해 자일라나제를 사용하는 경우가 많다.가수분해에는 옥수수 알갱이의 직접 효소적 가수분해와 옥수수 알갱이의 효소적 가수분해 [26]의 두 종류가 있다.옥수수 알맹이는 셀룰로오스와 리그닌이 풍부하기 때문에 옥수수 알맹이의 직접 효소가수분해시 자일라나제와 헤미셀룰로오스의 접촉면적이 작아 효소가수분해율이 낮다.옥수수 알갱이의 리그닌은 전처리를 통해 미리 제거할 수 있지만, 남아있는 셀룰로오스는 여전히 자란의 효소 가수분해를 방해한다 [27].따라서 다마소 등 [28]은 자일라나제를 이용하여 옥수수 알맹이로부터 최대 0.52 g/g의 자일로스를 얻었다.

연구진은 전처리된 옥수수 알갱이를 가수분해하기 위해 셀룰라아제와 자일라아제를 혼합하였는데, 자일란 가수분해 속도를 높일 수는 있지만 셀룰로오스의 가수분해로 생성되는 다량의 포도당은 자일로오스 환원효소의 활성을 저해하고, 효모 가 혐기성 호흡을 통해 에탄올을 생성하게 하여 궁극적으로 자일리톨의 생성을 감소시켰다 [29].반대로 옥수수 알널의 자가가수분해효소는 주로 자일란-올리고당을 함유하고 있으며, 단일 자일란제를 사용하거나 셀루라제와 혼합하여 다량의 포도당을 생산할 수 없고, 옥수수 알널의 자가가수분해효소의 자일란은 자일란제에 의해보다 쉽게 촉매되어 가수분해 속도를 높이고 가수분해 시간을 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라 [30]사용되는 효소의 양을 줄일 수 있다.다양한 가수분해 방법을 사용하면 헤미셀룰로오스 가수분해물의 품질이 달라지며, 이는 자일리톨 발효에 다른 영향을 미친다는 것을 알 수 있다.

헤미셀룰로오스 가수분해물의 처리 3.2

옥수수 알갱이의 헤미셀룰로오스 가수분해물 중 자일로스의 농도는 발효의 효율과 수율에 중요한 영향을 미치게 되므로 자일로스의 농도가 높은 헤미셀룰로오스 가수분해물을 얻는 방법은 자일리톨의 수율을 확보하기 위한 중요한 전제 조건이다.동시에 헤미셀룰로오스 가수분해물은 복잡한 성분과 다양한 종으로 구성되어 있습니다.특히 아세 트acid, furfural, tannins 등 독성물질이 발효에 미치는 영향을 과소평가해서는 안된다 [31,32].따라서 헤미셀룰로오스 가수분해물의 발효 전에는 헤미셀룰로오스의 발효능에 직접적인 영향을 미치는 가수분해물을 먼저 해독해야 한다.헤미셀룰로오스 가수분해물의 해독방법에는 주로 진공증발, 석회중화, 석회중화, 활성탄흡착, 이온교환수지흡착, 저온증발과 농도 [33,34] 등이 있다.

그 중 석회 중화와 중화 이상의 석회는 가장 산업화된 해독 방법이지만, 해독 프로젝트에서 다량의 당분이 생산되는 경우가 많아 자일리톨의 발효 수율을 떨어뜨리고, 동시에 중화 과정에서 생성되는 석고는 일련의 후속 장비와 처리 수단을 필요로 하여 생산 비용이 증가합니다 [32];활성탄 흡착은 해독 효과가 더 좋지만 동시에 자일로스를 다량 흡착해 자일리톨 수율 향상에는 도움이 되지 않는다;진공 농도를 사용하면 해독 효과를 높일 수있을뿐만 아니라 많은 양의 자일로스를 흡착하므로 자일리톨 생산의 개선에 이롭지 않습니다.진공 농도는 가수분해물의 자일로스의 농도를 향상시킬 수있을뿐만 아니라 대부분의 furfural, 아세트산 및 일부 휘발성 독성 성분 [35]을 제거할 수 있습니다.

그러나 적당한 농도비의 선택은 진공농도에 있어서 결정적이며 너무 높거나 너무 낮아도 합리한 해독을 얻을수 없다 [33].각각의 해독 방법은 고유의 특성을 가지고 있지만, 가수분해된 액을 단계별로 처리하는 여러 해독 방법을 함께 사용하면 좋은 결과를 얻을 수 있습니다.연구진은 활성탄 흡착과 이온교환수지를 결합시켜 해독 효과가 과다한 석회 [36]보다 좋음을 밝혀냈다.Martinez 등 [37]은 소량의 활성탄으로 처리한 후 석회 중화하여 79%의 자일리톨 수율을 얻었다.따라서 여러 해독 방법의 조합은 고품질의 헤미셀룰로오스 가수분해물을 생산하는 중요한 방법입니다.

헤미셀룰로오스 가수분해물을 기질로 하는 발효 조건 최적화 3.3

헤미셀룰로오스 가수분해물을 기질로 이용한 자일리톨 발효에서는 발효조건에 따라 기질, 온도, pH, 무기이온, 공중합체, 발효모드 등 자일리로스에서 자일리톨로 전환되는 정도에 영향을 미친다 [38,39].이러한 조건으로는 기질, 온도, pH, 무기이온, 에어레이션, 발효방법 등이 있다 [38,39].이러한 조건을 조절하면 세균의 발효능을 더욱 향상시킬 수 있다.이 조건들 중에서 기판과 에어레이션이 특히 중요하다.

헤미셀룰로스 가수분해물 중 자일로스의 농도는 자일리톨 생성에 큰 영향을 미친다.발효 과정에서 자일로스의 소비율과 자일리톨의 생산율은 양의 상관관계가 있어 가수분해물 중 자일로스 농도가 자일리톨 생산율을 효과적으로 증가시킬 수 있음이 증명되었다 [40].그러나 일정 범위를 초과하면 세균의 성장과 대사도 억제하여 자일리톨 생성이 감소하므로 가수분해 용액에서 자일리로스 농도의 최적화는 자일리톨 생성률을 높이는 중요한 조절 인자이다 [38].일반적으로, 대부분의 효모들의 초기 자일로스 농도는 낮은 수준이지만, 적합한 초기 자일로스 농도가 100 g/L에 달할 수 있는 고당 내성효모도 있다 [41].

이외에도 헤미셀룰로오스 가수분해물 [39]에는 포도당, 만노즈, 갈락토스, 아라비노스 등의 다른 당들도 존재한다.가수분해물에 만노즈, 갈락토오스, 아라비노스 등의 양이 적기 때문에 세균은 이들에 그다지 민감하지 않아서 [42]자일리톨 발효에 별다른 영향을 주지 못한다.비록 포도당의 존재는 자일로스의 쓸모없는 소비를 피하기 위해 박테리아가 자신의 성장과 대사에 우선적으로 사용될 수 있지만, 가수분해물 중 포도당의 비율의 차이는 산화-환원 전위의 변화를 초래하여 자일로스 대사와 관련된 효소의 활동과 비율에 영향을 미칠 뿐만 아니라 자일리톨 발효의 경로를 심각하게 억제할 수 있는 대사 억제 효과를 발생시킨다 [32].또한 포도당 농도가 일정 범위를 넘으면 세균이 자일리톨 발효에 저해가 되는 에탄올을 일정량 생성하게 된다 [37].따라서 균과 자일리톨 발효물의 성장과 대사에 적합한 당 농도를 최적화하고 확보하는 것이 필요하다.

발효 초기 단계에서 매질에 충분한 용존산소를 증가시키면 한편으로는 세균의 빠른 성장을 유도하고 에탄올과 같은 자일리톨 발효에 불리한 부산물의 생산을 줄일 수 있다;반면, 정체 기간을 단축하기 위해 [43]아세트산, furfural 및 기타 억제제를 섭취하게 할 수 있다.그러나 충분히 용존된 산소 하에서 자일리톨 탈수소효소에 의해 생성된 NADH는 호흡 사슬에 의해 다시 NAD+로 산화되고, 이는 자일리톨의 산화와 탈수소화를 더 일으켜 자일루오스를 형성한다.따라서 자일리톨은 엄격하게 제한된 산소 공급 조건 하에서만 대량으로 축적될 수 있으며, 다양한 공기 및 발효 전략의 선택은 자일리톨 생산에 큰 영향을 미친다 [44].위의 문제를 해결하기 위해 일부 연구자들이 자일리톨을 여러 가지 통기속도에 따라 발효시키는 것을 조사한 후 일정한 호기성 발효를 위해 적당한 통기속도를 선택하였는데, 통기속도는 간단하지만 자일리톨 발효에 대한 규정도 미비하고 산물의 축적에 불리하다 [41].

다른 연구자들은 고호기성 발효를 했다가 저호기성 발효를 하는 전략을 채택했는데, 발효 초기에 높은 호기성 속도를 이용해 세균이 많이 자라게 한 다음, 이에 따라 호기성 속도를 줄여 자일리톨이 축적되도록 하는 것이다.PreziosiBlloy 등 [45]은 Candi한uilliermondii의 헤미셀룰로오스 가수분해물에서 높은 후 낮은 부분 산소화를 사용하여 80%의 자일로스 전환을 이루었다.또한 왕등 (46)은 헤미셀룰로오스 가수분해물을 기질로 하는 자일리톨 발효에서 3단계 산소화 전략, 즉, 첫째, 세균이 증식하게 하기 위해 높은 공기화 (high aeration;박테리아가 일정 농도에 도달한 후, 박테리아가 적응하도록 하기 위해 중간 에어레이션을 짧은 시간 유지하였고, 그 후 계속해서 에어레이션을 낮추어 자일리톨이 축적되도록 하였으며, 이러한 전략을 적용하여 자일리톨 생산량이 더욱 향상되었다.

자일리톨 생산 발효에 고정화 적용 4

현재 자일리톨의 발효를 위해 고정화 기술을 이용하는 것도 유망한 개발 방향이다.고정화 세포 발효는 자유 발효와 비교하여 재사용성, 발효 생산 주기 단축, 제품의 분리, 정제 및 후처리 용이성, 세포 밀도가 높고 안정성이 높으며 산, 알칼리 및 온도 변화에 강한 저항성 [47,48] 등의 장점이 있다.따라서 이는 중요한 연구가치와 경제적가치를 갖고있다.세포의 고정화는 발효의 안정성을 향상시키고 발효 효율을 크게 높일 수 있으며, 이와 같은 연속적인 다회분식 발효를 실현할 수 있다:Prakash 등 [49]은 초기 자일로스의 100 g/L 농도에서 칼슘 알긴산 (calcium alginate)을 고정화한 D. hansenii와 자일리톨의 전환율은 0.82 g/g에 달하였고 5회 연속 발효시 이론치의 98%로 유지되었다.자일리톨 전환은 5회 연속 발효시 이론치의 98%를 유지하였다.

세포 고정화 기술의 핵심은 고정화 캐리어의 성능에 있으며, 고품질의 캐리어는 독성이 없고, 물질 전달이 좋으며, 가격이 저렴하고 수명이 길다 [50]는 장점이 있다.고정화 발효에서는 세포의 종류와 특성에 따라 다른 고정화 방법이 요구된다 [51].무기물질과 유기물질을 결합하여 형성된 복합캐리어는 두 재료 모두 갖는 장점 때문에 최근 뜨거운 연구주제가 되고 있다.

등리홍 등 52은 PVA의 질량 농도가 세포 입자의 인산염 저항성과 기계적 강도에 크게 영향을 미쳤으며, 이는 Pseudohyphae tropical은세포의 복합 내장을 위해 polyvinyl alcohol (PVA)과 sodium alginate 가 사용되었을 때 복합 운반체의 성능을 조절하는데 결정적인 역할을 하였다.일반적으로 사용되는 고정화 방법은 흡착법, 공유법, 교차연결법, 내장법 [53]의 네 가지이다.예를 들어, 리등 [18]은 클로닝으로 얻어진 이중조효소 의존형 파스퇴르픽추 효모 X-33을 고정시키기 위해 칼슘 알긴산 겔 내장법을 사용하였으며, 자일로스 발효 후 자일리톨의 전환율은 37.5%였다.왕등 (53)은 옥수수 알갱이에 탈색 및 이온교환 없이 가수분해된 열대 Pseudohyphomyces 효모를 폴리우레탄에 의해 고정시켰다.왕등 53)은 폴리우레탄을 이용하여 Pseudomon로tropicalis를 고정화하여 옥수수 알갱이 가수분해물의 자일로스를 탈색작용 및 이온교환작용 없이 직접 전환시킨 결과 자일리톨 수율과 생산율은 21일간의 발효시험 12회에서 각각 71.2%와 2.10 g/(L-h)에 달하여 산업적 발전 가능성이 큰 고정화 방법이라 할 수 있다.

5 요약

바이오 페이퍼먼트에 의한 크실리톨의 생산은 대체 할 수 없는 장점과 큰 발전 가능성을 가지고 있습니다.본 논문에서는 자일리톨 생산 균주, 헤미셀룰로오스 가수분해물을 기질로 이용한 자일리톨 발효, 자일리톨에 고정화 기술을 적용한 3가지 사항을 요약하였다.또한 바이오가공을 통한 자일리톨 생산의 주요 연구방향, 즉, 유전공학기술의 이용, 유전자변형을 통한 고효율, 고수율의 유전공학박테리아의 제조, 자일리톨 발효의 기질로서 헤미셀룰로오스 가수분해물의 이용, 고정화 기술의 이용,다양한 고정매체와 고정방법을 이용하여 발효의 효율과 생산속도를 높이는 것.이러한 연구방향이 점차 심화됨에 따라 자일리톨의 바이오생산 공정이 더욱 성숙되어 향후 자일리톨의 바이오생산 산업화에 일정한 토대를 마련할 것으로 생각된다.

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