발효를 통해 유비퀴논 코엔자임 Q10을 생산하는 방법은?

코엔자임 Q10 (유비퀴논-10, 코엔자임 Q10, COQ10):유비퀴논 (유비퀴논, COQ10, COQ10) 이라고도 한다.분자식은 C59 H90 O4 이고 분자량은 863이다.구조식은 다음과 같다:

유비퀴논 코엔자임 Q10 상온에서 주황색 결정이고 녹는점이 49 ℃인 지용성 퀴논 화합물이며, 냄새가 없고 맛이 없다 [1].COQ10의 생리학적 기능은 주로 퀴논 모이어티 (quinone moiety)의 산화 환원 특성과 아이소프노이드 (isoprenoid) 측 사슬의 물리적 특성에 기인한다.연구결과 환원된 상태의 COQ10과 모든 트랜스 구조를 가진 이소프렌 단량체가 산소가 첨가된 상태의 COQ10과 모든 시스 구조를 가진 이소프렌 단량체보다 높은 활성 및 약리학적 효과를 나타내었다.

COQ10의 역할은 1940년 MOOre 등이 처음 규명하였으나 임상적 관심을 많이 끌지 못하다가 1957년 Crane 등이 소의 심근에서 COQ10을 정제하고 그 화학구조를 측정하여 실제로 COQ10이 포유동물의 호흡수송사슬에서 산화환원전달체로서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.

유비퀴논 코엔자임 Q10 호흡기 사슬에서 NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase 및 bc 복합체 사이의 지용성 전자 전달체로 알려져 있으며, 세포 에너지 생성 요소이기 때문에 천연 항산화 제 및 세포 대사의 활성제이며, 심혈관 질환의 치료에 중요하며, 인간의 면역력을 향상시키고 인간의 면역계 질환을 치료할 수 있습니다.천연 항산화제로서 건강 및 미용에 사용할 수 있다 [2].중국에서는 COQ10 캡슐의 사용이 매년 증가하고 있으나 원료는 기본적으로 수입에 의존하고 있어 저렴한 COQ10원료와 준비물을 국내에서 대량으로 생산해야 한다.

1 COQ10 생산방식

COQ10은 식물 및 동물 조직뿐만 아니라 미생물 유기체에서도 널리 발견된다.미생물의 유기체는 일반적으로 높은 수준의 COQ10을 함유하고 있는 반면, 동식물 조직은 낮은 수준의 COQ10을 함유하고 있어 미생물은 COQ10의 좋은 공급원이 된다.

유비퀴논 코엔자임 Q10 동물 및 식물 조직 추출, 미생물 발효 및 화학 합성의 세 가지 방법으로 제조 할 수 있습니다.현재, 동물 및 식물 조직 추출은 대부분 중국에서 사용됩니다.해외 국가들은 대부분 미생물 발효를 사용하고 있으며, 특히 일본에서는 1977년에 일찍이 미생물 발효에 의한 COQ10의 공업생산이 실현되었다.

화학 합성 방법은 가혹한 조건과 많은 단계로 특징지어집니다;또한, COQ10의 아이소프렌 단량체 대부분은 생물학적으로 활성이 없는 cis-structure 이며, 부산물의 함량이 높아 정화비용이 높다.동물 및 식물 조직 추출 방법은 주로 시토크롬 C 추출 후 돼지 심장의 잔류물에서 추출합니다.동물조직 내 COQ10의 함량은 신선한 돼지 심장 [3]의 kg 당 75 mg에 불과하여 생산량이 낮고, 원료와 원료의 제한으로 대규모 생산이 제한된다.

반대로,의 생산 유비퀴논 코엔자임 Q10 미생물 발효에 의해 몇 가지 기본 장점이 있습니다:(1) 발효 산물은 자연적이고 생물학적으로 활발하며 인체에 쉽게 흡수됩니다;(2) 원료의 제한이 없으며, 규모화를 통해 생산능력을 높일 수 있다.그러나 그 함량이 제한되고 효률이 낮으며 생산원가가 높다는것은 일정한 정도에서 공업화를 제한하고있다.유전자 변형에 적합한 균주를 선택할 수 있고, 성능이 우수한 균주를 방향성 선택하여 박테리아 내 COQ10의 함량을 높일 수 있다면 생산 비용이 크게 절감될 것이다.

COQ10 생산을 위한 미생물 발효의 발전 2

2.균주의 1 종 선택

자연계 미생물 중 COQ10의 함량이 높음에도 불구하고 발효산물은 다양한 COQ10 혼성물질이 혼합되어 있어 COQ10 정화비용이 많이 소요되고 있다.따라서 COQ10의 발효를 위한 균주의 선발이 우선적으로 중요하다.COQ10의 발효에 사용된 미생물은 하기 표 1에 기재하였다.

COQ10의 함량 표 1  미생물 (microbial) [4]

위의 표에서 광합성 박테리아 (이후 PSB로 칭함)의 체내 COQ10의 함량이 일반적으로 높았음을 알 수 있다.분류학적 지위를 보면, PSB는 박테리아문 (phylum Bacteroidetes)에 속하여 아문 (Rhodobacteria)과 아문 (Green Thiobacteria)으로 구분되고, 전자는 아문 (Rhodobacteriaceae)과 아문 (Rhodobacteriaceae;R. capsulatus와 R. sphaeroides는 Rhodobacteriaceae에 속하며, 이는 coq10을 생산하는 균주에 이상적인 선택 중 하나이다.

2.균주의 유전자 변형 2

유비퀴논 코엔자임 Q10 야생형 균주의 생산 능력은 생산 수요를 충족시키기에 충분하지 않으며, 기존의 돌연변이 발생법과 유전공학 기술을 이용하여 유전자 변형이 가능하다. 

2.2.1 COQ10의 대사조절을 위한 육종

1976년 Rudney는 COQ10에 관한 국제 회의에서 COQ10의 미생물 합성 경로는 주로 방향족 고리 합성과 isoprenyl 사이드 체인의 생합성 경로로 나뉜다고 제안하였다.세균의 대사 조절 메커니즘과 결합된 방향족 고리 및 isoprenyl side chain의 생합성 경로에 따라, 산업용 발효에서 COQ10의 고생산성 균주의 육종을 위한 선택 경로는 다음과 같이 나눌 수 있다:

(1) 영양 결핍 돌연변이 균주의 선발 및 육종

OlsOn과 Rudney [5]는 카로티노이드와 COQ10은 모두 전구체로서 폴리이소프렌에 의해 동화되며, 카로티노이드의 생성을 줄이면 COQ10의 생합성을 촉진할 수 있음을 발견하였다.따라서 녹색 돌연변이 PSB 균주를 선정하면 COQ10 함량을 증가시킬 수 있었다.yOshida 등 [6]은 R. sphay-roides Ky-4113을 돌연변이화하고, 야생균주에 비해 COQ10 함량이 10~20% 증가한 녹색 돌연변이 균주를 얻었다.

(2) 대사길항성 돌연변이 균주의 선발 및 육성

COQ10 합성 또는 그와 관련된 동화작용에 대한 억제제의 제거는 COQ10 수준을 증가시켰다.yOshida 등 [6]은 COQ10 합성에 대한 전구물질, 억제제 및 구조적 유사체 (ethylthionine, L-methionine, methylnaphthoquinone, daunorubicin)에 대한 돌연변이 균주를 선별하여 야생균주보다 10~20% 높은 수준의 Agrobacterium tume"aciens 돌연변이 균주를 얻었다.aciens 돌연변이 균주는 wild strain보다 10-20% 높았다.

영양결핍 돌연변이 균주 및 구조적 유사체에 저항성을 갖는 이중 돌연변이 균주 등 조합적 돌연변이 균주를 여러 경로에 따라 추가로 선택하여 대상 산물의 생산량을 크게 증가시킬 수 있다.

2.2.유전자 조작 균주를 구성하는 2

분자생물학 기술을 이용하여 COQ10 생산 균주의 주요 효소 유전자를 찾고,이 유전자를 재조합 DNA 기술에 의해 생산 균주에 도입하여 주요 효소 유전자의 복사 수를 증가시키고 이를 효율적으로 발현시켜 유비퀴논 코엔자임 Q10을 합성하는 능력을 향상시키는 것이 재조합 COQ10발효 균주를 구성하기 위한 기본 경로이다.

다른 생물에서 COQ의 생합성에 있어서 속도 제한 단계는 파라벤 폴리이소프렌 파이로포스 트랜스페라제 효소에 의해 촉매된 폴리이소프렌과 하이드록시벤조산의 응결이다.이 효소에 대한 연구에 따르면 비교적 광범위한 기질 특이성을 가지고 있다 [7].이러한 원리를 바탕으로 ubiA 유전자를 대장균으로부터 클로닝 하여 PSB에 도입하였고,이 유전자의 발현을 증진시켜 COQ10의 고수율 균주를 얻었다.

반면 PSB는 유전공학을 위한 성숙한 수용체가 아니기 때문에 대장균을 수용체로 이용하는 대사경로 탐색으로 방향을 틀었다.COQ의 주요 성분의 측사슬 길이는 유전자에 의해 조절되는데 (예:대장균 ispB, 효소 coq1, 광합성 세균 dds1 등), 측사슬의 길이를 조절하는 유전자가 다르기 때문에 다른 생물의 세포마다 다르다.대장균은 고밀도로 배양하기 간단하고 외인성 유전자의 발현을 위한 체계가 잘 확립되어 있으나 대장균이 합성한 COQ의 주성분은 COQ8이다.

따라서 PSB 로부터 COQ10 (dds1)의 측사슬 길이를 조절하는 유전자를 복제하여 대장균 세포에 도입하고, 동시에 COQ8의 측사슬 제어 유전자인 ispB를 불활성화시켜 재조합 대장균에서 COQ10의 대규모 생산을 실현할 수 있다고 생각할 수 있다.현재 ShOkuhin 등은 대장균에서 COQ10을 합성하는 것이 가능하다는 것을 보여주었다 [8, 9].

2.발효 조건의 최적화 3

발효 수율을 향상시키기 위해 대사조절 이론을 응용하여 고수익 돌연변이 균주를 선발 및 품종하거나 재조합 균주를 구성하여 생산자 세균의 발효 조건을 최적화하는 것 또한 발효 수율을 향상시키기 위한 중요하고 효과적인 방법이다.

2.3.문화매체의 최적화 1

유비퀴논 코엔자임 Q10에서 배양액의 조성을 알아보기 위해 탄소, 질소, 성장인자 및 무기염류의 다양한 공급원을 선정하여 발효, 최적화 실험을 수행하였다.금속 이온, 특히 Mg2+, Fe2+, Mn2+은 R. sphaeroides의 발효에 의해 COQ10의 생성을 촉진시킬 수 있음이 밝혀졌다.12의 추가.2 mmOl/L MgSo4, 1. 8 mmOl/L FeSo4  ·7H2 o,0.9 mmOl/L mnso4-7h2 o는 2.0 mg/g dry wt에서 2.0 mg/g dry wt로, 0 mg/g dry wt에서 8로 COQ10 수율을 증가시켰다.9 화~9 화. 6 mg/g dry wt (Asahi Chemical Industry CO., Ltd., Ja-pan, 1981).또한, 전구체는 제품 수율을 현저히 높이고 특정 조건에서 박테리아 내 동화 생성물의 흐름을 제어 할 수 있습니다.COQ10발효물 생산시 첨가된다고 보고된 전구물질로는 p-hydroxybenzoic acid, mevalonic acid, isopentenol 및 geraniol [10]이 있다.

2.3.배양 조건의 최적화 2

(1) Mixing-Aeration

교반과 공기가 CoQ10 생성에 미치는 영향은 균주에 따라 다른데, 하나는 CoQ10 생성을 촉진하고 [11] 다른 하나는 이를 억제한다 [4, 12].기존 연구에 따르면, 동요 및 기류는 R. sphaeroides에 의한 CoQ10 생산에 불리하다.사카토 등은 CoQ10 생산을 위해 R. sphaeroides Ky8598발효액을 이용하여 동요 및 기공작용이 CoQ10 생산에 미치는 영향을 조사하였다 [13].그 결과 산화환원전위 (ORps) 가-150 mM 일 때 가장 좋은 세균성장이 이루어졌고, ORps 가-200 mM 일 때, 즉 산소공급의 제한이 세균성장과 CoQ10 생성에 모두 유리한 것으로 나타났다.

위의 연구를 바탕으로 Yoshida 등은 산소공급이 R. sphaeroides의 미세구조에 미치는 영향을 전자현미경으로 관찰하였다 [6].산소가 제한된 조건에서 자란 세균의 세포질 내막이 잘 발달되어 있고 다층구조를 가지고 있는 것으로 나타났는데, psB의 광반응중심이 위치한 곳에 CoQ10이 위치하고 있어 산소가 잘 공급된 조건에서 자란 세균보다 CoQ10의 함량이 높을 수 있는 것으로 나타났다.

(2) 햇빛

Rhodobacter sphaeroides는 특수한 혐기성 세균의 광합성과 호기성 호흡과 발효가 모두 가능하며, Car와 ExCell은 psB에 의한 CoQ10 생성이 밝은 곳에서 혐기성 조건에서 높으나, 일단 배양이 어두운 호기성 조건으로 전환되면 극적으로 감소한다고 보고하였다 [4].

(3) 배양 시간

Yoshida 등은 세균이 안정화 전 기간일 때 CoQ10의 함량이 높게 나타났다 [6].또한 Zhu Xufen 등은 배양시간이 증가함에 따라 균내 CoQ10의 함량이 증가하였고, 안정화 전 기간 중반에 최고치에 도달하였다가 [14] 감소하기 시작하였다.

2.미생물 세포로부터 CoQ10 추출 4

미생물 세포에서 CoQ10을 추출하는 방법에는 미생화와 미생화 두 가지가 있다.무상추출은 무상추출로 얻는 추출물의 양이 무상추출로 얻는 것보다 적긴 하지만 [15] CoQ10을 파괴하지 않는다는 장점이 있다.Saponification은 지용성 물질을 추출하는 고전적인 방법으로, 간단하지만 비용이 많이 들어 현대 산업 생산에서 제거되고 있다 [1, 16].최근 제안된 알칼리 사포화 방법은 피로갈산 갈산 및 에탄올 용매의 소비를 완전히 제거할 수 있고, 산쇄세포를 직접 사포화하여 사용함으로써 CoQ10의 생산비용이 크게 절감되며, 따라서 산업화된 대량 생산에 적용이 가능하다.

3 전망

현재 시중에 나와 있는 CoQ10 제품의 가격은 높은 편이다.특히 중국에서는 대부분 CoQ10 제품을 수입하고 있는데 이는 균주의 발효 함량이 낮고 분리 및 정제 수율이 낮기 때문이다.따라서 미생물 발효에 의한 CoQ10의 산업적 생산을 실현하기 위해서는 기존의 미생물 육종 방법과 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산 균주를 유전적으로 변형시키고, 세포 내 CoQ10의 함량을 증가시키며, 추출 경로를 최적화하여 추출 및 분리 비용을 절감할 필요가 있다.

참조:

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