이상지질혈증에 흑미 추출물 효능에 대한 연구

흑미는 안토시아닌의 함량이 높아 검은색을 띤다.Xia et al. [1]과 Ling et al. [2] [3]은 동물 실험 연구를 통해 식용 흑미가 실험동물의 혈중지질 수준을 낮추고, 동맥경화증의 발생과 발달을 억제할 수 있다는 것을 발견했으며,이 효과가 종자 외투의 안토시아닌과 관련이 있다고 추측하고 있다.또한 흑미 추출물의 활성산소 소거 및 항산화 효과는 In vitro 화학 모사 실험에서 일부 확인되었다 [4] [5] [6] [7].그러나 흑미 추출물의 주요 활성 성분과 체내 생리활성에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

본 논문은 고지혈증 쥐에 대한 흑미 추출물의 효능을 연구하고 안토시아닌과 지방산의 조성 및 함량을 분석하였다.흑미 추출물의 안토시야노사이드와 불포화지방산은 흑미의 항산화 및 지질 저하 효과에 중요한 물질적 기반임을 추론하였다.

Ⅰ다.재료 및 공법

1.1 실험재료

1.1.1시약 및 기구

총 항산화능 (TAC), glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성, malondialdehyde (MDA) 함량 및 superoxide dismutase (SOD) 활성은 Nanjing Jianji한Bioengineering Research Institute;총 콜레스테롤 (TC)과 중성지방 (TG)은 북경중생생명공학하이테크회사에서 제공하였다;LDL-C와 HDL-C는 원저우 동생물공학회사가 제공했다.총 콜레스테롤 (TC)과 중성지방 (TG) 키트는 북경중생생명공학하이테크회사에서 제공하였다;저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C)과 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL-C) 키트는 원저우 동방생물공학회사가 제공했다.분석에 사용된 다른 모든 화학 시약은 국내 분석 순수 시약이었습니다.

흑미 추출물 1.1.2 준비

흑미 품종은 " 장진 1" 이었다지린농업과학원 벼연구소에서 재배하고 광둥농업과학원 생명공학연구소에서 제공했다." 장진 1"의 신선한 흑미(40 mesh)를 50 °C에서 60% 에탄올을 용매로 추출하고 감압하에서 농축하여 검붉은 시럽 흑미 껍질 추출물을 수득하였다.

…의 준비흑미 추출물증류수에 녹여 5%, 10%, 20% 용액으로 제조하여 저, 중, 고의 세 가지 BRPE 시험군의 gavage 재료로 사용하고 4 ℃에서 저장하였으며, 제조 후 2주 이내에 사용하였다.

실험동물 및 집단 1.1.3

몸무게 160±20 g의 청정 등급 수컷 SD 쥐 60 마리를 광저우 한의과대학 실험동물센터에서 제공했다.이 동물들은 환경에 적응하기 위해 정상적인 사료를 1주 동안 먹였고, 이후 안와정맥 신경에서 혈액을 채취했다.동물을 총 콜레스테롤 수준에 따라 대조군, 모델군, 저용량, 중용량, 고용량 BRPE의 실험군 3개의 5 그룹으로 나누어 각 그룹마다 12 마리의 쥐를 대상으로 실험설계에 따라 다른 사료를 먹인 후 실험기간에 접어들었다.

동물 먹이 및 취급 1.2

광저우 (廣州) 중의약대학 (中醫藥大學) 청정동물실험실에서 동물 먹이가 완성되었다.모든 쥐 그룹은 그룹에 따라 별도의 우리에 수용되었으며, 기초식이로 공급된 대조군을 제외한 나머지 4 그룹은 고지방 식이 (기초식이가 85%, 달걀노른자가루 10%, 돼지기름 5%, 천산나트륨 0.5% 함유) 되었다.실험기간 동안 대조군과 모델군에게는 매일 1ml/100g body weight의 식염수를 가배지에 의해 투여하였고, 5%, 10%, 20% BRPE 군에게는 각각 1ml/100g body weight의 5%, 10%, 20% BRPE를 투여하고 ad libitum을 먹이고 물을 먹였으며, 섭취한 음식의 양은 매 3일마다 기록하였다.실험기간은 8주였다.실험 후 동물들을 8 h 동안 금식시킨 후 눈을 제거하여 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였으며,이 혈청은-20℃에 나누어 보관하여 향후 사용할 수 있도록 하였다.자묘동물은 자궁경부 탈구법으로 살처분하였으며, 간을 분리하여-20℃에서 저장하였다.

탐지 색인과 방법 1.3

모든 플랫폼의 혈중 지질 결정CHOD-PAP 효소법에 의한 TC, HDL-C 및 TG.혼합형 이상 직접적인 방법을 사용 하여 측정 되는, 자동 생화 학적 분석기 7060 합니다.

플라즈마 LDL의 분리, 정화, 산화 1.3.2. 

혈장 LDL은 밀도 구배 원심분리로 분리하였고, LDL 단백질 함량은 Lowry&로 측정하였다#39; s 방법이다.LDL 단백질 함량은 Lowry&로 측정하였다#39;s 법, 그리고 Cu2+ oxidation [8]에 의해 LDL의 산화적 개질을 수행하였다.LDL의 순도와 산화도는 agarose gel 전기영동을 통해 확인하였고, LDL의 변형정도는 relative electrophoretic mobility (REM)로 측정하였다.전기영동 결과 ox-LDL의 REM은 1.4로 나타났다.

1.3.3 쥐 혈청에서의 Anti-ox-LDL 항체 역가 측정 

단백질의 지시에 따르면 DetectroTM 엘리사 키트, 희석 ox-LDL 준비하고 자연 스러 운 LDL의 농도는 1 × 10 개의 µ g 단백질 코팅 해결책이다.준비 된 ox-LDL하고 자연 스러 운 LDL 희석 농도은 10 µ g protein-ml-1 1 × 코팅 솔루션과 4 ° C에서 하룻밤 배양 접시에 있을 것이다.판은 3번 씻 겨 진 세척 액과 나서 접시를 100 µ g protein-ml-1에 추가 됩니다.판은 3번 씻 겨 진 버퍼 씻고, 다음 보조과 희석 된 1:500 항체 솔루션 100 µ l의 1 × BSA Diluent/차단 솔루션은고 1 h 상온에서 동안 배양 할 덧 붙였다.

씻은 철저 한 후, 100 µ l의 기질를 추가 하여 해결책을 추가하고 반응이 종료 되었습니다었100 µ l의 반응 30 민과 후 종료 솔루션 효소 미터 405 nm에서 읽었다.혈청 내 anti-ox-LDL 항체의 역가는 ox-LDL의 흡광도 값에서 LDL의 흡광도 값을 뺀 값으로 표현된다 [9].

1.3.4 간 조직 균질액의 제조 및 단백질 함량 결정 

간 조직을 취하여 차가운 식염수에 헹군 후 혈액을 제거하고 여과지로 닦아 무게를 측정하고 균질화 매질로 멸균된 식염수를 사용하여 4℃에서 10% 간 균질산 (w:v)을 만들고 3,000g에서 4℃에서 15분간 원심분리한 후 초산액을 1인분씩 취하여-20℃에 저장하고 사용할 수 있도록 예약한 후 Bradford&로 단백질 함량을 확인한다#39; s 방법이다.

1.3.5 혈청 및 간 총 항산화능 (TAC), SOD, GSH-Px 활성 및 MDA 함량을 측정하였다 

kit의 지침에 따라 TAC, SOD, GSH-Px 효소 활성 및 MDA를 분광광학적으로 측정하였다.

추출물의 안토시아닌 함량 측정 1.3.6

독립적으로 정제되어 크로마토그래피 순도 기준을 충족하도록 확인된 4가지 안토시야노사이드, 즉 cornflowerin-3-glucoside, cornflowerin-3,5-diglucoside, geraniolin-3,5-diglucoside, mallowin을 표준으로 사용한 후 [7], HPLC 법으로 결정하였다.

지방산 함량 측정 1.3.7추출물에서 지방산 함량은 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)로 분석한다.

1.4 데이터 처리 및 통계 분석

통계분석을 위해 SPSS 10.0 software package를 사용하였다.분산도의 동질성 (Homogeneity 의variances)은 다중집단의 평균에 대해 검정하였다;분산이 균질하지 않은 경우에는 변수들을 교환한 후 일원분산분석 (one-way ANOVA;집단 간 2회 비교에는 LSD 방법을 사용하였다.

Ⅱ다.결과 및 분석

흑미껍질 추출물이 고지혈성 쥐의 혈중 지질에 미치는 영향 2.1

표 1은 각 군별 쥐의 지질수준을 나열한 것으로, 이를 통해 모델군과 비교하여 세 가지 BRPE 군의 혈청 TC, TG 농도가 대조군에 근접하거나 오히려 낮았으며 (P<0.05), 세 가지 BRPE 군 간에 일정 용량 효과 관계가 있고, 세 가지 BRPE 군의 HDL-C 함량이 모델군에 비해 유의적으로 높은 것을 알 수 있다 (P<0.05).세 BRPE 군 모두에서 HDL-C 수치가 모델군에 비해 유의하게 높았다 (P<0.05).또한 10%와 20% BRPE는 LDL-C 수준을 감소시킬 수 있었으나 (P<0.05), 5% BRPE는 유의한 효과가 없었다 (P>0.05).

표 1 흑미 추출물이 쥐의 혈중지질 농도에 미치는 영향 (mmol·L-1, x±s, n=12)

CG = 대조군,MG = 모형군

공통 위첨자 문자가 없는 열의 값은 P<0.05로 유의하게 다릅니다.이하 같다.

흑미 추출물이 고지혈성 쥐의 죽상경화지수에 미치는 영향 2.2

죽상경화지수 (AI)는 죽상경화증 (AS)의 위험을 반영하기 위해 혈중 지질의 여러 지표를 통합한 매개변수이며, AI 가 증가하면 AS 가능성이 증가함을 시사한다.표 2는 세 투여군의 AI1 및 AI2 값이 모델군에 비해 유의하게 낮았다 (P<0.05), 그리고 세 군간에 투여량 효과 관계가 있었다.

흑미 추출물이 쥐의 동맥경화지수에 미치는 영향 표 2 (x ± s, n = 12)

AI1 = (TC-HDL-C)/apo , AI2 = 혼합형/apo

고지혈성 쥐에 대한 흑미 추출물의 항산화 효과 2.3

총 항산화능력 2.3.1

고지혈증이 발생하였을 때 모델군 쥐의 혈청 및 간 TAC는 대조군보다 낮았다.BRPE의 섭취는 쥐에서 TAC를 증진시켰으며, 그 중 BRPE의 저용량은 간 TAC를 증가시키는 경향이었으나 그 차이는 유의적이지 않았으나 (P>0.05), 본 실험군의 동물의 혈청 TAC는 모델 대조군에 비하여 유의적으로 증진되었다 (P<0.05).10%와 20% BRPE는 혈청 및 간 TAC를 유의적으로 향상시켰으며, 그 중 20% BRPE 군의 혈청 TAC 수치가 대조군보다 높았다.10%와 20% BRPE는 혈청 및 간 TAC를 유의적으로 증진시켰으며, 20% BRPE 군이 대조군보다 혈청 TAC 수치가 높았다 (P<0.05).

흑미 추출물이 쥐의 혈청 및 간의 총 항산화능에 미치는 영향 표 3 (x±s, n =12)

항산화 효소 활성 및 지질과산화 생성물 함량 2.3.2

장기간의 고지방 식이의 섭취는 쥐의 혈중지질 수준을 증가시켰고, GSH-Px와 SOD의 활성을 감소시켰으며, 지질과산화생성물 (MDA)의 함량을 유의적으로 증가시켰다 (P<0.05).BRPE의 섭취는 항산화 효소의 활성을 증진시켰고 일정한 정량적 효과 관계를 보였다 (P<0.05).이에 따라 세 투여군의 쥐의 MDA 함량은 모델군보다 유의적으로 낮아 (P<0.05) 유의한 정량적 효과관계를 보였다 (표 4).

표 4의 효과흑미 추출물은 항산화 효소 활성 및 Malondialdehyde 함량에쥐의 혈청 및 간에서 (x±s, n = 12)

져 있 Anti-ox-LDL 항체 수준

ox-LDL은 인체를 자극하여 항체를 생성할 수 있으며, 항체 수준은 ox-LDL의 생성을 어느 정도 반영할 수 있다.표 5에 나타난 바와 같이 LDL-C 수준의 증가와 함께 모델군의 항옥소 ldl 항체 수준이 대조군보다 유의적으로 높았으며 (P<0.05), BRPE의 섭취는 항옥소 ldl 항체 생성을 유의적으로 감소시켜 용량 의존적인 관계를 보였다.

표 5 흑미 추출물이 쥐의 혈청 항옥-ldl 항체 수준에 미치는 영향 (x±s, n =12)

표 6  흑미 추출물의 Anthocyan에서함량

2. 4 흑미 추출물의 성분 분석

안토시아닌 함량 2.4.1

흑미 추출물에서 cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3, 5-diglucoside, geranium-3,5-diglucoside, malachit에서등 4가지 안토시아닌이 검출되었다.그 중 cyanidin-3-glucoside 가 가장 높은 함량을 보였고 그 다음으로 cyanidin-3, 5-diglucoside, malachitin이 가장 낮은 함량을 보였다.표 6에 나타낸 바와 같이 안토시아닌 4 종의 총 함량은 43.43 g/100g 이었다.

지방산 함량 2.4.2

흑미 추출물의 지방산 조성은 불포화 특성이 높다.검출된 14개 지방산 중 6개가 불포화지방산으로 전체 지방산의 87.66%를 차지한다.지방산의 비율이 가장 높은 것은 올레산과 리놀레산이다 (표 7).

표 7 흑미 추출물의 지방산 함량

Ⅲ다.토론

3. 1에서 검은 쌀 추출의 효과는 지질 유기체의 신진대사와 Anti-Oxidative 스트레스 수준

고지혈증은 AS의 독립적인 위험인자이다.특히 LDL-C 등 지질의 수치의 증가는 AS의 발생과 직접적인 관련이 있으며 HDL-C는 콜레스테롤 역운반체 촉진과 항산화 활성 [10]으로 인해 일정한 항 AS 효과가 있다.따라서 (TC-HDL)/HDL의 값은 AS의 위험성을 어느 정도 반영할 수 있다 [11].

본 연구에서 흑미 추출물의 섭취는 고지방 초유 쥐에서 혈청 TC, TG 및 LDL-C 수치를 감소시키고 HDL-C 수치를 증가시켜 지질대사를 개선시키고 AS의 위험성을 감소시키는 것으로 확인되었으며, 섭취효과에 대한 양적인 의존성이 큰 것으로 나타났다.연구에 따르면 고지혈증은 산화적 스트레스의 주요 유발물질이며 [12], 산화적 스트레스에 의해 생성된 활성산소는 LDL을 더욱 산화, 변형시켜 ox-LDL을 형성하는데, 이는 내피기능장애를 유도하고 단핵세포에 의한 지질의 식균작용을 촉진하여 포말세포를 형성하며 [13] 혈관세포에 의한 다량의 사이토카인과 유착분자의 합성과 분비를 촉진함으로써 강력한 as 유발 효과를 발휘한다.

이번 연구에서 ox-LDL 생성은 흑미 추출물을 섭취한 쥐에서 현저하게 감소되어 혈관에 미치는 해로운 영향을 감소시켰다.ox-LDL 생성의 감소는 흑미껍질 추출물에 의한 쥐의 LDL 감소, 체내에서 과다하게 생성된 활성산소 (reactive oxygen radicals)를 제거하여 LDL의 산화적 변형을 방지하는 항산화효소의 증대에 기인한 것으로 보인다.

3.2 흑미껍질 추출물의 항고지혈증 및 항산화 효과

본 연구에서 흑미 추출물은 지질대사를 개선하고 항산화 효소의 활성을 증진시키며 지질과산화 생성물의 형성을 감소시켜 항산화 및 현질성 생물학적 활성을 보유할 수 있음이 밝혀졌다.이 결과는 시아 등 [1]과 링 등 [2] [3]이 발견한 흑미 또는 흑미 껍질의 효과와 일치한다.

현재 연구에서 에탄올 추출로 얻은 흑미 껍질 추출물에는 흑미 색소와 쌀겨 기름이 풍부했으며 [14][15] 안토시야노사이드가 흑미 색소의 주성분임이 확인되었다.안토시노사이드와 쌀겨유는 생리기능이 활발하여 많은 주목을 받았다.따라서 본 연구에서는 흑미 추출물에 함유되어 있는 안토시야노사이드와 지방산의 조성과 함량에 초점을 두었다.그 결과 추출물에는 cornflower-3-glucoside와 같은 안토시야노사이드가 43.43%, linoleic acid와 같은 불포화지방산이 14.5% 함유되어 있었다.

안토시아노사이드의 항산화 활성에 대한 연구는 널리 보고되고 있으며, Kano [16] 등은 자색고구마에 함유된 안토시아노사이드가 생체 내 및 체외에서 항산화 활성을 가지고 있음을 증명하였다.Sun Ling [7] 등과 Zhang Mingwei [6] 등은 흑미 품종별 에서vitro 항산화활성이 종자 외투의 총 안토시아닌 함량과 매우 유의적인 양의 상관관계를 보임으로서 (p<0.01), 이는 흑미 또는 그 추출물의 항산화 효과가 안토시아닌 화합물과 밀접한 관련이 있음을 시사한다.따라서 안토시야노사이드는 흑미 추출물의 항산화 효과에 있어 주요 활성 물질일 수 있다.

흑미 피부 추출물에 풍부한 불포화지방산인 oleic acid와 linoleic acid는 n-6 계열의 불포화지방산에 속한다.의학영양학 연구에 따르면 n-3 및 n-6 계열의 불포화지방산은 혈중 TC 감소와 지질대사 개선에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.Allman-F 등은 식단에서 올레산이 풍부한 해바라기씨 오일이 혈중 TC와 LDL 수치를 낮출 수 있다는 사실을 발견했다.

현재 안토시아닌이 혈중 지질대사에 미치는 영향에 대한 연구는 상대적으로 적다.타카노리 등 [18]은 시아니딘 3-glucoside 가 풍부한 보라색 옥수수 색소를 고지방 식이에 첨가하고 12주 동안 쥐에게 먹였다.고지방 식이만을 투여한 것에 비해 생쥐의 혈청 TG 함량이 현저히 감소되었다는 것을 발견하였다.야마코시 [19] 등은 안토시아닌의 전제 조건인 프로시아니딘을 토끼에게 먹이면 토끼 혈액 내 LDL 수치를 낮추고 죽상경화판의 형성을 줄일 수 있다는 사실을 밝혀냈다.연구 결과를 바탕으로 안토시아닌과 불포화지방산이 흑미 추출물에서 항산화 및 지질 저하 효과를 발휘하는 주요 활성 물질일 것으로 추측된다.

Ⅳ다.결론

본 연구에서 흑미 추출물의 주성분을 분석한 결과 cornflower-3-glucoside와 같은 anthocyanoside 가 43.43%, 지방산이 16.6% 함유되어 있었으며,이 중 87.66% 가 불포화지방산이었다.다양한 용량의 흑미 추출물을 투여하면 고지혈증 쥐의 혈중 지질 수준을 낮추고 체내 산화 스트레스를 개선할 수 있다.이를 통해 흑미 추출물에 함유되어 있는 안토시야노사이드와 불포화지방산을 유추할 수 있었다 흑미의 항산화 및 지질 저하 효과의 중요한 물질적 기반이었다.

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