이상지질혈증에 흑미 추출물 효능에 대한 연구

흑미는 안토시아닌의 함량이 높아 검은색을 띤다.Xia et al. [1]과 Ling et al. [2] [3]은 동물 실험 연구를 통해 식용 흑미가 실험동물의 혈중지질 수준을 낮추고, 동맥경화증의 발생과 발달을 억제할 수 있다는 것을 발견했으며,이 효과가 종자 외투의 안토시아닌과 관련이 있다고 추측하고 있다.또한 흑미 추출물의 활성산소 소거 및 항산화 효과는 In vitro 화학 모사 실험에서 일부 확인되었다 [4] [5] [6] [7].그러나 흑미 추출물의 주요 활성 성분과 체내 생리활성에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

논문 연구Black Rice 추출물의 이점고지혈증 쥐에 대해 그리고 안토시아닌과 지방산의 조성과 함량을 분석한다.흑미 추출물의 안토시야노사이드와 불포화지방산은 흑미의 항산화 및 지질 저하 효과에 중요한 물질적 기반임을 추론하였다.

Ⅰ다.재료 및 공법

1.1 실험재료

1.1.1시약 및 기구

총 항산화능 (TAC), glutathione peroxidase (GSH-Px) 활성, malondialdehyde (MDA) 함량 및 superoxide dismutase (SOD) 활성은 Nanjing Jianji한Bioengineering Research Institute;총 콜레스테롤 (TC)과 중성지방 (TG)은 북경중생생명공학하이테크회사에서 제공하였다;LDL-C와 HDL-C는 원저우 동생물공학회사가 제공했다.총 콜레스테롤 (TC)과 중성지방 (TG) 키트는 북경중생생명공학하이테크회사에서 제공하였다;저밀도 지단백 콜레스테롤 (LDL-C)과 고밀도 지단백 콜레스테롤 (HDL-C) 키트는 원저우 동방생물공학회사가 제공했다.분석에 사용된 다른 모든 화학 시약은 국내 분석 순수 시약이었습니다.

흑미 추출물 1.1.2 준비

흑미 품종은 " 장진 1" 이었다지린농업과학원 벼연구소에서 재배하고 광둥농업과학원 생명공학연구소에서 제공했다." 장진 1"의 신선한 흑미(40 mesh)를 50 °C에서 60% 에탄올을 용매로 추출하고 감압하에서 농축하여 검붉은 시럽 흑미 껍질 추출물을 수득하였다.

흑미 추출물의 제조는 증류수에 녹여 5%, 10%, 20% 용액으로 제조하여 BRPE 시험군 중 저, 중,고 3 군의 가배지 재료로 사용하고 4 ℃에서 저장하였으며, 제조 후 2주 이내에 사용하였다.

실험동물 및 집단 1.1.3

몸무게 160±20 g의 청정 등급 수컷 SD 쥐 60 마리를 광저우 한의과대학 실험동물센터에서 제공했다.이 동물들은 환경에 적응하기 위해 정상적인 사료를 1주 동안 먹였고, 이후 안와정맥 신경에서 혈액을 채취했다.동물을 총 콜레스테롤 수준에 따라 대조군, 모델군, 저용량, 중용량, 고용량 BRPE의 실험군 3개의 5 그룹으로 나누어 각 그룹마다 12 마리의 쥐를 대상으로 실험설계에 따라 다른 사료를 먹인 후 실험기간에 접어들었다.

동물 먹이 및 취급 1.2

광저우 (廣州) 중의약대학 (中醫藥大學) 청정동물실험실에서 동물 먹이가 완성되었다.모든 쥐 그룹은 그룹에 따라 별도의 우리에 수용되었으며, 기초식이로 공급된 대조군을 제외한 나머지 4 그룹은 고지방 식이 (기초식이가 85%, 달걀노른자가루 10%, 돼지기름 5%, 천산나트륨 0.5% 함유) 되었다.실험기간 동안 대조군과 모델군에게는 매일 1ml/100g body weight의 식염수를 가배지에 의해 투여하였고, 5%, 10%, 20% BRPE 군에게는 각각 1ml/100g body weight의 5%, 10%, 20% BRPE를 투여하고 ad libitum을 먹이고 물을 먹였으며, 섭취한 음식의 양은 매 3일마다 기록하였다.실험기간은 8주였다.실험 후 동물들을 8 h 동안 금식시킨 후 눈을 제거하여 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였으며,이 혈청은-20℃에 나누어 보관하여 향후 사용할 수 있도록 하였다.자묘동물은 자궁경부 탈구법으로 살처분하였으며, 간을 분리하여-20℃에서 저장하였다.

탐지 색인과 방법 1.3

모든 플랫폼의 혈중 지질 결정CHOD-PAP 효소법에 의한 TC, HDL-C 및 TG.혼합형 이상 직접적인 방법을 사용 하여 측정 되는, 자동 생화 학적 분석기 7060 합니다.

플라즈마 LDL의 분리, 정화, 산화 1.3.2. 

혈장 LDL은 밀도 구배 원심분리로 분리하였고, LDL 단백질 함량은 Lowry&로 측정하였다#39; s 방법이다.LDL 단백질 함량은 Lowry&로 측정하였다#39;s 법, 그리고 Cu2+ oxidation [8]에 의해 LDL의 산화적 개질을 수행하였다.LDL의 순도와 산화도는 agarose gel 전기영동을 통해 확인하였고, LDL의 변형정도는 relative electrophoretic mobility (REM)로 측정하였다.전기영동 결과 ox-LDL의 REM은 1.4로 나타났다.

1.3.3 쥐 혈청에서의 Anti-ox-LDL 항체 역가 측정 

단백질의 지시에 따르면 DetectroTM 엘리사 키트, 희석 ox-LDL 준비하고 자연 스러 운 LDL의 농도는 1 × 10 개의 µ g 단백질 코팅 해결책이다.준비 된 ox-LDL하고 자연 스러 운 LDL 희석 농도은 10 µ g protein-ml-1 1 × 코팅 솔루션과 4 ° C에서 하룻밤 배양 접시에 있을 것이다.판은 3번 씻 겨 진 세척 액과 나서 접시를 100 µ g protein-ml-1에 추가 됩니다.판은 3번 씻 겨 진 버퍼 씻고, 다음 보조과 희석 된 1:500 항체 솔루션 100 µ l의 1 × BSA Diluent/차단 솔루션은고 1 h 상온에서 동안 배양 할 덧 붙였다.

씻은 철저 한 후, 100 µ l의 기질를 추가 하여 해결책을 추가하고 반응이 종료 되었습니다었100 µ l의 반응 30 민과 후 종료 솔루션 효소 미터 405 nm에서 읽었다.혈청 내 anti-ox-LDL 항체의 역가는 ox-LDL의 흡광도 값에서 LDL의 흡광도 값을 뺀 값으로 표현된다 [9].

1.3.4 간 조직 균질액의 제조 및 단백질 함량 결정 

간 조직을 취하여 차가운 식염수에 헹군 후 혈액을 제거하고 여과지로 닦아 무게를 측정하고 균질화 매질로 멸균된 식염수를 사용하여 4℃에서 10% 간 균질산 (w:v)을 만들고 3,000g에서 4℃에서 15분간 원심분리한 후 초산액을 1인분씩 취하여-20℃에 저장하고 사용할 수 있도록 예약한 후 Bradford&로 단백질 함량을 확인한다#39; s 방법이다.

1.3.5 혈청 및 간 총 항산화능 (TAC), SOD, GSH-Px 활성 및 MDA 함량을 측정하였다 

kit의 지침에 따라 TAC, SOD, GSH-Px 효소 활성 및 MDA를 분광광학적으로 측정하였다.

추출물의 안토시아닌 함량 측정 1.3.6

독립적으로 정제되어 크로마토그래피 순도 기준을 충족하도록 확인된 4가지 안토시야노사이드, 즉 cornflowerin-3-glucoside, cornflowerin-3,5-diglucoside, geraniolin-3,5-diglucoside, mallowin을 표준으로 사용한 후 [7], HPLC 법으로 결정하였다.

지방산 함량 측정 1.3.7추출물에서 지방산 함량은 Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)로 분석한다.

1.4 데이터 처리 및 통계 분석

통계분석을 위해 SPSS 10.0 software package를 사용하였다.분산도의 동질성 (Homogeneity 의variances)은 다중집단의 평균에 대해 검정하였다;분산이 균질하지 않은 경우에는 변수들을 교환한 후 일원분산분석 (one-way ANOVA;집단 간 2회 비교에는 LSD 방법을 사용하였다.

Ⅱ다.결과 및 분석

흑미껍질 추출물이 고지혈성 쥐의 혈중 지질에 미치는 영향 2.1

표 1은 각 군별 쥐의 지질수준을 나열한 것으로, 이를 통해 모델군과 비교하여 세 가지 BRPE 군의 혈청 TC, TG 농도가 대조군에 근접하거나 오히려 낮았으며 (P<0.05), 세 가지 BRPE 군 간에 일정 용량 효과 관계가 있고, 세 가지 BRPE 군의 HDL-C 함량이 모델군에 비해 유의적으로 높은 것을 알 수 있다 (P<0.05).세 BRPE 군 모두에서 HDL-C 수치가 모델군에 비해 유의하게 높았다 (P<0.05).또한 10%와 20% BRPE는 LDL-C 수준을 감소시킬 수 있었으나 (P<0.05), 5% BRPE는 유의한 효과가 없었다 (P>0.05).

표 1 흑미 추출물이 쥐의 혈중지질 농도에 미치는 영향 (mmol·L-1, x±s, n=12)

CG = 대조군,MG = 모형군

공통 위첨자 문자가 없는 열의 값은 P<0.05로 유의하게 다릅니다.이하 같다.

흑미 추출물이 고지혈성 쥐의 죽상경화지수에 미치는 영향 2.2

죽상경화지수 (AI)는 죽상경화증 (AS)의 위험을 반영하기 위해 혈중 지질의 여러 지표를 통합한 매개변수이며, AI 가 증가하면 AS 가능성이 증가함을 시사한다.표 2는 세 투여군의 AI1 및 AI2 값이 모델군에 비해 유의하게 낮았다 (P<0.05), 그리고 세 군간에 투여량 효과 관계가 있었다.

흑미 추출물이 쥐의 동맥경화지수에 미치는 영향 표 2 (x ± s, n = 12)

AI1 = (TC-HDL-C)/apo , AI2 = 혼합형/apo

고지혈성 쥐에 대한 흑미 추출물의 항산화 효과 2.3

총 항산화능력 2.3.1

고지혈증이 발생하였을 때 모델군 쥐의 혈청 및 간 TAC는 대조군보다 낮았다.BRPE의 섭취는 쥐에서 TAC를 증진시켰으며, 그 중 BRPE의 저용량은 간 TAC를 증가시키는 경향이었으나 그 차이는 유의적이지 않았으나 (P>0.05), 본 실험군의 동물의 혈청 TAC는 모델 대조군에 비하여 유의적으로 증진되었다 (P<0.05).10%와 20% BRPE는 혈청 및 간 TAC를 유의적으로 향상시켰으며, 그 중 20% BRPE 군의 혈청 TAC 수치가 대조군보다 높았다.10%와 20% BRPE는 혈청 및 간 TAC를 유의적으로 증진시켰으며, 20% BRPE 군이 대조군보다 혈청 TAC 수치가 높았다 (P<0.05).

흑미 추출물이 쥐의 혈청 및 간의 총 항산화능에 미치는 영향 표 3 (x±s, n =12)

항산화 효소 활성 및 지질과산화 생성물 함량 2.3.2

장기간의 고지방 식이의 섭취는 쥐의 혈중지질 수준을 증가시켰고, GSH-Px와 SOD의 활성을 감소시켰으며, 지질과산화생성물 (MDA)의 함량을 유의적으로 증가시켰다 (P<0.05).BRPE의 섭취는 항산화 효소의 활성을 증진시켰고 일정한 정량적 효과 관계를 보였다 (P<0.05).이에 따라 세 투여군의 쥐의 MDA 함량은 모델군보다 유의적으로 낮아 (P<0.05) 유의한 정량적 효과관계를 보였다 (표 4).

표 4 흑미 추출물이 항산화 효소 활성 및 쥐의 혈청 및 간의 Malondialdehyde 함량에 미치는 영향 (x±s, n = 12)

져 있 Anti-ox-LDL 항체 수준

ox-LDL은 인체를 자극하여 항체를 생성할 수 있으며, 항체 수준은 ox-LDL의 생성을 어느 정도 반영할 수 있다.표 5에 나타난 바와 같이 LDL-C 수준의 증가와 함께 모델군의 항옥소 ldl 항체 수준이 대조군보다 유의적으로 높았으며 (P<0.05), BRPE의 섭취는 항옥소 ldl 항체 생성을 유의적으로 감소시켜 용량 의존적인 관계를 보였다.

표 5 흑미 추출물이 쥐의 혈청 항옥-ldl 항체 수준에 미치는 영향 (x±s, n =12)

표 6  흑미 추출물의 Anthocyan에서함량

2. 4 흑미 추출물의 성분 분석

안토시아닌 함량 2.4.1

흑미 추출물에서 cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3, 5-diglucoside, geranium-3,5-diglucoside, malachit에서등 4가지 안토시아닌이 검출되었다.그 중 cyanidin-3-glucoside 가 가장 높은 함량을 보였고 그 다음으로 cyanidin-3, 5-diglucoside, malachitin이 가장 낮은 함량을 보였다.표 6에 나타낸 바와 같이 안토시아닌 4 종의 총 함량은 43.43 g/100g 이었다.

지방산 함량 2.4.2

흑미 추출물의 지방산 조성은 불포화 특성이 높다.검출된 14개 지방산 중 6개가 불포화지방산으로 전체 지방산의 87.66%를 차지한다.지방산의 비율이 가장 높은 것은 올레산과 리놀레산이다 (표 7).

표 7 흑미 추출물의 지방산 함량

Ⅲ다.토론

3. 1에서 검은 쌀 추출의 효과는 지질 유기체의 신진대사와 Anti-Oxidative 스트레스 수준

고지혈증은 AS의 독립적인 위험인자이다.특히 LDL-C 등 지질의 수치의 증가는 AS의 발생과 직접적인 관련이 있으며 HDL-C는 콜레스테롤 역운반체 촉진과 항산화 활성 [10]으로 인해 일정한 항 AS 효과가 있다.따라서 (TC-HDL)/HDL의 값은 AS의 위험성을 어느 정도 반영할 수 있다 [11].

본 연구에서 흑미 추출물의 섭취는 고지방 초유 쥐에서 혈청 TC, TG 및 LDL-C 수치를 감소시키고 HDL-C 수치를 증가시켜 지질대사를 개선시키고 AS의 위험성을 감소시키는 것으로 확인되었으며, 섭취효과에 대한 양적인 의존성이 큰 것으로 나타났다.연구에 따르면 고지혈증은 산화적 스트레스의 주요 유발물질이며 [12], 산화적 스트레스에 의해 생성된 활성산소는 LDL을 더욱 산화, 변형시켜 ox-LDL을 형성하는데, 이는 내피기능장애를 유도하고 단핵세포에 의한 지질의 식균작용을 촉진하여 포말세포를 형성하며 [13] 혈관세포에 의한 다량의 사이토카인과 유착분자의 합성과 분비를 촉진함으로써 강력한 as 유발 효과를 발휘한다.

이번 연구에서 ox-LDL 생성은 흑미 추출물을 섭취한 쥐에서 현저하게 감소되어 혈관에 미치는 해로운 영향을 감소시켰다.ox-LDL 생성의 감소는 흑미껍질 추출물에 의한 쥐의 LDL 감소, 체내에서 과다하게 생성된 활성산소 (reactive oxygen radicals)를 제거하여 LDL의 산화적 변형을 방지하는 항산화효소의 증대에 기인한 것으로 보인다.

3.2 흑미껍질 추출물의 항고지혈증 및 항산화 효과

본 연구에서 흑미 추출물은 지질대사를 개선하고 항산화 효소의 활성을 증진시키며 지질과산화 생성물의 형성을 감소시켜 항산화 및 현질성 생물학적 활성을 보유할 수 있음이 밝혀졌다.이 결과는 시아 등 [1]과 링 등 [2] [3]이 발견한 흑미 또는 흑미 껍질의 효과와 일치한다.

현재 연구에서 에탄올 추출로 얻은 흑미 껍질 추출물에는 흑미 색소와 쌀겨 기름이 풍부했으며 [14][15] 안토시야노사이드가 흑미 색소의 주성분임이 확인되었다.안토시노사이드와 쌀겨유는 생리기능이 활발하여 많은 주목을 받았다.따라서 본 연구에서는 흑미 추출물에 함유되어 있는 안토시야노사이드와 지방산의 조성과 함량에 초점을 두었다.그 결과 추출물에는 cornflower-3-glucoside와 같은 안토시야노사이드가 43.43%, linoleic acid와 같은 불포화지방산이 14.5% 함유되어 있었다.

안토시아노사이드의 항산화 활성에 대한 연구는 널리 보고되고 있으며, Kano [16] 등은 자색고구마에 함유된 안토시아노사이드가 생체 내 및 체외에서 항산화 활성을 가지고 있음을 증명하였다.Sun Ling [7] 등과 Zhang Mingwei [6] 등은 흑미 품종별 에서vitro 항산화활성이 종자 외투의 총 안토시아닌 함량과 매우 유의적인 양의 상관관계를 보임으로서 (p<0.01), 이는 흑미 또는 그 추출물의 항산화 효과가 안토시아닌 화합물과 밀접한 관련이 있음을 시사한다.따라서 안토시야노사이드는 흑미 추출물의 항산화 효과에 있어 주요 활성 물질일 수 있다.

흑미 피부 추출물에 풍부한 불포화지방산인 oleic acid와 linoleic acid는 n-6 계열의 불포화지방산에 속한다.의학영양학 연구에 따르면 n-3 및 n-6 계열의 불포화지방산은 혈중 TC 감소와 지질대사 개선에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다.Allman-F 등은 식단에서 올레산이 풍부한 해바라기씨 오일이 혈중 TC와 LDL 수치를 낮출 수 있다는 사실을 발견했다.

현재 안토시아닌이 혈중 지질대사에 미치는 영향에 대한 연구는 상대적으로 적다.타카노리 등 [18]은 시아니딘 3-glucoside 가 풍부한 보라색 옥수수 색소를 고지방 식이에 첨가하고 12주 동안 쥐에게 먹였다.고지방 식이만을 투여한 것에 비해 생쥐의 혈청 TG 함량이 현저히 감소되었다는 것을 발견하였다.야마코시 [19] 등은 안토시아닌의 전제 조건인 프로시아니딘을 토끼에게 먹이면 토끼 혈액 내 LDL 수치를 낮추고 죽상경화판의 형성을 줄일 수 있다는 사실을 밝혀냈다.연구 결과를 바탕으로 안토시아닌과 불포화지방산이 흑미 추출물에서 항산화 및 지질 저하 효과를 발휘하는 주요 활성 물질일 것으로 추측된다.

Ⅳ다.결론

본 연구에서 흑미 추출물의 주성분을 분석한 결과 cornflower-3-glucoside와 같은 anthocyanoside 가 43.43%, 지방산이 16.6% 함유되어 있었으며,이 중 87.66% 가 불포화지방산이었다.다양한 용량의 흑미 추출물을 투여하면 고지혈증 쥐의 혈중 지질 수준을 낮추고 체내 산화 스트레스를 개선할 수 있다.이를 통해 흑미 추출물에 함유되어 있는 안토시야노사이드와 불포화지방산을 유추할 수 있었다 흑미의 항산화 및 지질 저하 효과의 중요한 물질적 기반이었다.

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