바닐린의 생합성이란?

바닐린은 바닐린, 바닐린, 바닐린 알데히드 등으로도 알려진 바닐라의 주성분이다.화학 이름은 4-히드 록시-3-메 톡시 벤즈 알데히드 (4-히드 록시-3-메 톡시 벤즈 알데히드), 상대 분자 질량 152.15, 흰색에서 밝은 노란색 결정 분말 또는 바늘 결정입니다.바닐린은 바닐라 콩의 건조 중량의 2~3%를 차지하는 글루코사이드로서 자유로운 형태로 식물 내에 존재한다.순수 바닐린은 우윳빛 향이 강하고 냄새가 없다.바닐린은 향수와 향료로 사용되는외에 제약공업의 중요한 원료와 중간체이며 전기도금광택제, 식물생장촉진제, 숙성제 등으로도 사용될수 있어 사용범위가 다양하다.

바닐린은 세계에서 가장 큰 합성 향신료로 연간 소비량이 약 1만 2000 t에 달하며, 지금도 그 수요는 매년 10%씩 증가하고 있다.바닐라에서 추출하여 조제한 천연 바닐린의 생산량은 연간 약 20~50 t에 불과할 정도로 적고, 나머지 소비 공백은 화학적 합성법으로 메우고 있는데, 단일 아로마로 인해 불순물이 되기 쉬운 등 피할 수 없는 단점이 많지만 피플 '의 천연 바닐린에 대한 수요는 항상 증가 추세에 있다.

천연 바닐린의 수요는 항상 증가하고 있다.바닐라의 재배는 기후와 지리적 조건에 의해 제한을 받고, 향의 가공도 복잡하기 때문에 바닐린의 생산이 시장 수요를 만족시키기 어렵다.생물학적 방법은 천연 바닐린 [1]을 합성할 수 있으며, 오염이 적고, 생산이 깨끗하며 안전하다는 장점이 있다.현재 보고된 생물학적 방법에는 미생물발효, 식물세포배양, 효소법 등이 있다.

1 미생물 발효

1977년 타다사 K는 유제놀을 바닐린으로 전환할 수 있는 코리네박테리움 sp. 균주를 분리하였고 [2], 이는 바닐린을 생물학적으로 조제할 수 있는 새로운 방법을 열어주었다.이어서 많은 세균과 곰팡이가 eugenol, isoeugenol, ferulic acid, glucose 등의 화합물을 바닐린으로 전환시킬 수 있음을 알 수 있었으며, 다양한 기질을 이용하여 미생물 발효에 의해 바닐린을 합성할 수 있었다.

1.1 Eugenol 또는 Isoeugenol을 기질로 한다

유제놀 및 이의 이성질체 이소유제놀, 주로 라비아타의 정향 바질의 휘발성 기름에서 유래된 유제놀의 화학명은 4-프로페닐-2-메톡시 페놀 [2-메톡시-4-(2-프로페닐)-페놀] 이며, 이소유제놀의 화학명은 4-프로페닐-2-메톡시 페놀 [2-프로페닐-4-(1-프로페닐)-페놀]이다.이소유제놀의 화학명은 4-프로페닐-2-메톡시 페놀 [2-메톡시-4-(1-프로페닐)-페놀] 이며, 둘다 화학적 또는 생물학적으로 바닐린으로 전환될 수 있다.이외에도 코리네박테리움 (Corynebacterium sp.), 세라티아 (Serratia sp.), 클레브시엘라 (Klebsiella sp.), 엔테로박터 (Enterobacter sp.), 헤미프테라 (Hemiptera) 계열의 일부 균류도 유제놀 (eugenol)을 바닐린 (vanillin)으로 변환시킬 수 있다 [3, 4].게다가 세라티아 마르세센스, 클레브시엘라 마르세센스, 엔테로박터 마르세센스는 이소유제놀을 바닐린으로 전환할 수 있다.Bacillus subtilis와 Rhodococcus subtilis는 또한 isoeugenol을 바닐린으로 변환할 수 있다.

rhodochrous) 또한 이소유제놀을 바닐린으로 전환하는 능력을 보유하고 있다 [5, 6].

Hemiptera 급의 곰팡이균주에 의한 eugenol의 바닐린으로의 전환은 최대 0.0271 g/L로 높은 수확량을 나타내지 못하였다 [4].Bacillus subtilis B2 균주는 유일한 탄소원으로 isoeugenol을 사용하고 0.61 g/L의 수율과 몰 수율 (isoeugenol의 경우) 12.4%의 바닐린으로 전환할 수 있다 [5];B. purpurea MTCC 289 균주가 isoeugenol을 기질로 사용할 때, 실험실에서의 최적 배양 조건에서 바닐린 (isoeugenol의 경우)의 몰 수율은 58%까지 높아질 수 있다 [6].

Serratia marcescens 균주 DSM 30126도 이용되었지만 [3] 기판에 따라 결과는 크게 달랐다.바닐린 (eugenol의 경우)의 수율은 0.018 g/L로 0.1%에 불과하였으나, 바닐린 (isoeugenol의 경우)의 수율은 20.5%로 3.8 g/L 이었다.반대로 isoeugenol을 기질로 사용하여 얻은 바닐린의 수율은 20.5% 였고, isoeugenol을 기질로 사용하여 얻은 바닐린의 수율은 20.5%였다.반대로 isoeugenol을 기질로 하여 얻은 바닐린의 수율이 eugenol을 기질로 한 것보다 높았는데,이 또한 authors&의 결과였다#39;세라티아 마르세센스 균주 AB 90027로 발효.미생물 발효에 의한 바닐린 생산에는 eugenol보다 Isoeugenol이 더 적합한 기질이다.

1.2 페룰산 (Ferulic Acid) 기질로

화학적으로 4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid로 알려진 Ferulic acid는 옥수수 글루텐 및 곡물 이랑과 같은 농업 부산물에서 널리 발견됩니다.페룰산 (ferulic acid)을 기질로 이용하여 발효시켜 바닐린을 생산하는 방법에는 두 가지가 있는데, 하나는 단일 세균의 작용이 필요하고, 다른 하나는 여러 균주의 세균이 복합적으로 작용해야 한다.

발효에 의한 바닐린 생산에 사용된 균주의 단일균주는 Bacillus coagulans 계열의 특정 균주, 토양실 균주 (Amycolatopsis sP.) 등이 보고되었다 [4, 7, 8].Hemiptera [4] 계열의 진균균주를 이용하여 0.0552 g/L의 바닐린만을 얻었다.반대로, 바닐린은 ferulic acid를 유일한 탄소원으로 사용하는 Bacillus coagulans 균주 BK 07에 의해 4-vinylguaiacol 로부터 생산되었다.이 균주는 ferulic acid의 95% 이상을 7 h 이내에 대사 할 수 있으며, 주요 생성물은 지금까지 보고된 ferulic acid 중 가장 빠른 대사 과정인 4-vinylguaiacol이다 [7].Rabenhorst J 등이 발명한 특허 방법에서 [8], 토양실 세균인 DSM 9992 균주를 사용하여 페룰산을 11.5 g/L의 높은 수율로 바닐린으로 전환하였다.이 과정의 메커니즘은 아직 보고되지 않았습니다.

" 2단계 생물 변환 방법"Lesage-Meessen L et al [1]에 의해 제안된 것으로 Aspergillus niger와 pycnoporus cinnabarinus를 이용하여 전체 전환 과정을 완료하는 여러 균주의 복합 작용에 의한 바닐린 생산의 대표적인 예이다.이 방법은 Aspergillus niger와 Pycnoporus cinnabarinus의 조합을 이용한다.우선 Aspergillus niger는 ferulic acid를 0.92 g/L의 수율과 88%의 몰수율로 전환한 후, Pycnoporus cinnabarinus에 의해 0.237 g/L의 수율과 22%의 바닐린으로 환원시켰다.최근, 그들 [9]은 페룰산을 유일한 탄소원으로 옥수수 겨로 바꾸고, " 2단계 생물 전환 방법"을 만들었다.아무런 정화 조치 없이 바닐린 결정을 얻기 위해.

[10, 11] 연구에 따르면, M. verticillioides에 의해 바닐릭산이 바닐린으로 환원되는 동안, 부산물인 methoxyhydroquinone의 생성으로 인해 바닐린의 수율이 감소하게 된다;매질내 바닐린의 mass 농도가 1.0 g/L를 초과하면 M. verticillioides에 매우 독성이 있어 M. verticillioides의 성장을 늦출 수 있으며 동시에이 균주의 다량의 증식은 바닐린의 생성에 도움이 되지 않는다.이 시스템에 cellobiose를 첨가하였을 경우 hydroxymethoxyquinone의 생성이 현저히 감소하였고, 바닐린 수율은 0.725 g/L로 3.3배 증가하였다.적절한 양의 XAD-2 수지가 흡착된 바닐린을 첨가하면 매질 내 바닐린의 질량농도와 균주의 성장속도를 조절할 수 있고, 기계적으로 교반된 생물반응기를 사용하면 물질전달 효과를 크게 향상시킬 수 있었으며, 바닐린의 수율은 1.575 g/L에 이를 수 있었다.이상의 결과로 볼 때 본 시스템에서의 바닐린 생성은 배지 생성에 유리하지 않았으며, 배지 생성에 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

1.기질로서의 포도당 3

전분 가수분해로 포도당을 얻을 수 있는데, 이는 비용이 적게 들면서도 충분한 원료이지만, 바닐린을 생성하기 위한 기질로 포도당을 생물변환시킨 경우는 단 한 가지 뿐이다 [12].우선 대장균 재조합 물질 (Escherichia coli KL7/PKL5)에 의해 포도당이 바닐산으로 전환되었다.26A 또는 KL7/PKL5.97A), 그리고 나서 뉴로스포라크라사에서 분리한 방향족 알데히드 탈수소효소에 의해 바닐릴산을 환원시켜 바닐린을 생성하였다.글루코스-기질 생물전환법을 천연 바닐린 생산에 산업적으로 적용 가능한 기술로 만들기 위해서는 대장균에서 재조합체의 안정적인 발현이 해결되어야 한다.

요약하면, 포도당은 저렴하지만, 대장균의 재조합 물질의 안정적인 발현을 실현하는 방법이 실용화의 핵심이다;원료 자원의 관점이나 현재 중국의 바이오 기술 현황에서 볼 때, 바닐린 생산을 위한 기질로서 isoeugenol과 ferulic acid의 생물 전환은 더욱 유망한 발전 전망을 가지고 있다.

2 식물 세포 배양 방법

현대 생명공학 기술의 발전은 세포배양을 이용하여 바닐린을 생산하려는 발상과 실천으로 이어지고 있다.첫 번째 것은 세포에 의한 바닐린의 엑소시토시스 특성을 활용한 바닐라 플라놀리아 세포의 인공 배양이었으나, 단위 부피당 수율은 약 0.01 g/L에 불과하여 높지 않았다 [13].최근에는 capsicum &과 같은 특정 첨가물을 바닐린으로 전환하는 새로운 방법이 발견되었습니다#39; rutescens cells'[다].

이러한 세포 배양과 바닐린의 생산은 첨가제와 세포 성장 환경 등의 요인에 영향을 받는다 [17].Cao Mengde 등 13)은 다양한 식물호르몬의 종류와 농도의 첨가는 세포성장에는 큰 영향을 미치지 않았지만 바닐린의 생성에 큰 영향을 미쳤으며, 나프탈렌아세트산과 6-벤질아데닌을 혼합한 결과 더 많은 바닐린이 생성되었다.바닐린의 형성은 세포 성장과 음의 상관관계가 있으며, 즉, 느린 세포 성장은 목표 산물의 형성에 유리하므로, 바닐린 세포의 배양과 바닐린의 생산을 위해 2단계 배양 방법을 고려할 수 있다 [18].

정지 배양에서 바닐린을 생산하는 식물 세포 외에도 첨가제를 바닐린으로 전환할 수 있는 관목 고추 세포와 Haematococcus pluoialis 세포도 있다 [14-16].세포 정지 배양의 단점인 고정되지 않은 세포 위치, 불리한 세포 조직, 배양 조건 제어의 어려움 등으로 인해 목표 산물인 바닐린의 수율이 높지 않아 세포 고정화 배양에 의해 향상시킬 수 있어 바닐린의 수율을 높일 수 있다.

앞에서 언급한바와 같이 관목칠리 세포는 isoeugenol, protocatechuic aldehyde, caffeic acid와 같은 일부 특정 첨가제를 바닐린으로 전환할 수 있다.표 1은 관목 고추 세포의 고정화 중 첨가물과 관련하여 vanillin의 최대 생성량과 그 발생량을 보여준다 [14, 15].

볼 수 있는 isoeugenol 가 가장 좋은 3의 첨가 제, 그리고 그것은 더 효과적인 만약 β-cyclodextrin isoeugenol의 용해도를 개선 하기 위해 추가 되는 그것의 세포에 독성을 줄이고, 아니면 니제르 균 균 사체 가 inducer 로서 추가 됩니다.관목고추 세포와 비슷하게 R. rainbowii 세포도 페룰산이나 테레빈유를 바닐린 [16]으로 바꿀 수 있다.바닐린의 최대 수율은 고형화 과정에서 페룰산 (1.0 mmol/L의 농도)을 첨가한 경우 0.0106 g/L, 테레빈산 알데히드 (1.0 mmol/L의 농도)를 첨가한 경우 0.0205 g/L 이었다.결론적으로 바닐린 생산을 위한 기존 식물세포배양액의 효율은 높지 않으며, 아직 산업화와는 거리가 멀다.

3 효소

모든 생체반응은 효소작용이며, 앞서 설명한 다양한 방법들의 작용기작은 아직 명확하지 않지만 하나 이상의 효소의 작용에 의해 생성된다고 판단할 수 있다.이러한 효소를 분리하여 효소반응에 활용할 수 있다면 바닐린은보다 직접적으로 생산될 수 있다.

네덜란드 와게닝겐 대학교의 van den Heuvel Robert H H 등 [19]은 바닐린이 바닐릴 알코올 산화효소 (VAO)에 의해 두 가지 방법으로 생성될 수 있음을 발견하였다.하나는 VAO의 존재하에 바닐릴알코올을 경유하여 목타르알코올로부터 바닐린을 생산하는 것이다.다른 경우, 바닐라민은 알칼리 조건에서 VAO에 의해 바닐린으로 직접 가수 분해 될 수있는 중간 생성물로 전환됩니다.고추와 캡사이신은 효소적으로 분해되어 바닐린을 생성할 수 있기 때문에, 후자의 경로는 더 풍부한 원료 공급원을 제공하고 더 높은 경쟁력을 제공합니다.특허 [20]에 치라짐 L 이라는 효소가 보고되었다 20] chirazyme L-2, c-f, c2 lyo 라는 리파아제가 isoeugenol과 pine aldehyde를 각각 질량분획이 30.4%와 83.1%인 바닐린으로 전환할 수 있었으며,이 리파아제가 Candida 남극에서도 분리될 수 있음을 보고하였다.

고효율, 전문화, 온화한 반응 조건, 제품의 쉬운 정화, 낮은 에너지 소비, 낮은 오염, 간단한 조작 및 쉬운 제어의 장점 때문에 디지털 반응은 비교할 수 없는 우월성을 가져야 합니다.그러나 효소이론, 화학공학 및 현대 생명공학을 이용하여 기존의 효소를 개조하고 고정화 기술을 연구하여 적합한 다중 효소 반응기를 개발하는 방법이 효소법에 의한 바닐린 생산을 위한 주요 과제가 될 것이다.

4 결론

생물학적 방법에 의한 바닐린 생산은 점점 더 많은 관심을 받고 있으며, Schniken (이탈리아), Boreai (노르웨이), Monsanto (미국)와 같은 세계의 많은 유명한 바닐린 생산회사들은 향후 향신료 시장에서 지배적인 위치를 차지하기 위해, 생물학적 방법에 의한 바닐린 생산에 대한 연구를 강화하고 있다.중국은이 측면에서 아직 초기 단계에 있으며, 현재 바닐린 세포의 정지 배양에 관한 화중과학기술대학의 Cao Mengde의 연구와 샤먼용취안그룹유한회사와 연계한 바이오 산화법에 의한 바닐린 생산에 관한 허페이공과대학의 야오리성의 연구만이 있을 뿐이다.

따라서 생합성 바닐린 시장에서 우리나라가 한 자리를 차지하도록 하기 위해서는 생산, 학습, 연구, 정부재정지원 등의 방법을 병행하여 활용하고 협력연구를 강화하여야 한다.따라서 중국이 생합성 바닐린 시장에서 한 자리를 차지할 수 있도록 산업계, 학계, 연구계, 정부 재정지원의 결합에 힘입어 협동연구를 늘려야 한다.

비록 바닐린의 비화학적 합성에 대한 연구가 많은 실질적인 진전을 이루었지만, 공업적 생산을 실현하기 위해서는 여전히 다음과 같은 문제들이 해결되어야 한다:우수한 엔지니어링 균주 확보;식물 세포 배양 기술 향상;다효소반응기 개발뿐만 아니라 효소의 분리, 정제 및 고정화 기술을 연구하고 있습니다.현재 상태를 보면 식물세포배양으로 바닐린을 생산하는 비용은 15,000 US 달러/kg까지 오를 것이고, 전통적인 방법으로 바닐라 콩에서 바닐린을 추출하는 비용은 4,000 US 달러/kg, 미생물 발효를 이용하는 비용은 약 1,000 US 달러/kg [17]이다.따라서 isoeugenol과 ferulic acid를 기질로 이용한 바닐린의 미생물 발효의 연구 및 개발은 중국의 바닐린 생산에 더욱 유망할 것이다.

참조:

[Lesage-Meessen L, Delattre M, Haon M 외.Aspergillus niger와 pycnoporus cinnabarinus [J]를 결합한 ferulic acid 로부터 바닐린 생산을 위한 2단계 생물전환 공정.및 pycnoporus cinnabarinus [J.J Biotechnol, 1996, 50:107-113.

[2] Tadasa K. 미생물 [J]에 의한 eugenol 분해.Agric Biol chem, 1977, 41(6):925-929.

[3] Rabenhorst J, Hopp R. 바닐린 (vanillin [p].미국:5 017 388, 1991-05-21.

[4] Bavutti Hamilton R F, Anazawa Tania A, Durrant Lucia R. study of vanillin synthesis by deuteromycete fungal 균주 [J].Braz symp chem Lingins 다른 나무 compon, 1997, 6:605-611.

[5] shimoni E, Ravid U, shoham Y. isoeugenol을 vanillin[J]으로 변형시킬 수 있는 Bacillus sp.를 분리.J Biotechnol, 2000, 78 (1):1-9.

[6] Rhodococcus rhodochrous[J]에 의한 isoeugenol의 바닐린으로의 미생물 전환 chatterjee T, De B K, Bhattacharyya D K. 인도 J 켐, 1999, 38B(5):538-541.

[7] 카르마카르 B, 보흐라 R M, 난단와르 H 외.새로 분리한 Bacillus coagulans 균주에 의한 4-vinylguaiacol과 vanillin을 통한 ferulic acid의 빠른 분해 (J. J Biotechnol, 2000, 80:195-202.

[8] 바닐린 제조를 위한 Rabenhorst J, Hopp R. 공정 및 이에 적합한 미생물.미국:6 133 003, 2000 I 10 I 17.[9] Lesage-Meessen L, Lomascolo A, Bonnin E 외.옥수수 기운 [J] 으로부터 천연 결정질 바닐린을 생산하기 위해 실 형태의 균류를 포함하는 생명공학 공정이다.옥수수 기운 [J] 으로부터 천연 결정질 바닐린을 생산하기 위해 실 형태의 균류를 포함하는 생명공학 공정이다.  Appl Biochem Biotech, 2002, 102/103:141 i 153.

[10] Bonnin E, Grang6 H, Lesage-Meessen L, 그 외.사탕무 과육으로부터 cellobiose의 효소방출, 그리고 이를 이용하여 vanillic acid 로부터 pycnoporus cinnabarinus의 vanillin 생산에 유리하도록 한다 [J. Carbohydr polym, 2000, 41:143 i 151.

[11] stentelaire C, Lesage-Meessen L, Oddou J 외.pycnoporus cinnabarinus의 scalable level에 의한 vanillic acid 로부터 vanillin 생산을 위한 균류 생물공정 설계 (Design of a fungal bioprocess for vanillin production at scalable level)J Biosci Bioeng, 2000, 89(3):223 i 230.

[12] Li K, Frost J W. synthesis of vanillin from 포도당 [J].J Am Chem soc, 1998, 120:10545 I 10546.

[13] 조맹드, 진동춘, 천치카이 외.바닐라 플래니폴리아 세포의 정지 배양에 의한 바닐린 생산에 관한 연구 (J.한국화종학회지 1998, 26(5):8-10.

[14] Ramachandra Rao s, Ravishankar G A.의 Biotransformation of isoeugenol to vanilla flavour metabolites and capsicum &의 정지 및 고정화 세포 배양에서 capsaicin#39; rutescens:연구의 영향의 β-cyclodextrin과 곰팡이 elicitor다 [J다]proc Biochem, 1999, 35:341 i 348.

[15] Ramachandra Rao s, Ravishankar G A. Biotransformation of protocatechuic aldehyde and caffeic acid to vanillin and capsaicin in 자유롭게 정지 및 고정화된 capsicum"rutescens"(J).J Biotechnol, 2000, 76:137 i 146.

[16] Tripathi U, Ramachandra Rao s, Ravishankar G A. Biotransformation of phenylpropanoid compounds to vanilla flavor metabolites in Haematococcus pluvialis [J] 배양에서 바닐라향 대사산물에 대한 페닐프로파누드 화합물. Haematococcus pluvialis [J] 배양에서 바닐라향 대사산물에 대한 phenylpropanoid 화합물의 Biotransformation에 관한 연구 (Ravishankar G A.

[17] 송강, 조진송, 펑지잉.바닐린 [J]의 생합성.식품발효산업, 2001, 27(7):72-74.

[18] 조맹드, 리자루, 진동춘 외.바닐라 플래니폴리아 세포의 정지 배양에서 흡착제와 중간조성이 바닐린의 생성에 미치는 영향 (J.식물학연구, 2002, 22(1):65-67.

[19] van den Heuvel Robert H H, Fraaije Marco W, Laane C 등.바닐린 [J]의 효소합성.J Agric Food Chem, 2001, 49(6):2954 i 2958.

[20] 가트필드 I-L, 힐머 J-M.스티렌으로부터 방향족 카보닐 화합물 제조 공정 [p.미국:6 331 655, 2001 I 12 I 18.