D 알룰로스 분말의 생산 방법은 무엇입니까?

1 d-알룰로스 개요

D 알룰로스는 헥소스 당이며 D-fructose의 C-3에피머이다.높은 단맛, 낮은 에너지 함량, 독특한 생리 기능 및 잠재적인 건강 혜택으로 인해 d-알룰로오스는 잠재력이 큰 새로운 감미료로 간주됩니다.세계적으로 희귀한 당 생합성 분야의 연구 거점이 됐다.그러나 d-알룰로스는 자연계에서 극히 드물고 화학적으로 합성하기 어렵다.반면 생합성 방법은 절차가 간단하며 최근 몇 년간 큰 발전을 이루었다.따라서, 저자는 d-알룰로오스의 생합성에 관한 최근의 연구진척을 살펴보면서, d-알룰로오스의 공급원, 효소적 특성, 결정구조, 촉매기전, 이형 발현 및 이와 관련된 주요 효소들의 분리 및 정제과정을 다루면서, d-알룰로오스의 물리화학적 특성, 생리학적 기능, 응용, in 생체 실험대사, 효소적 생산 등을 다룬다.

1.1 물리화학적 특성과 d-알룰로오스의 원천

d-알룰로스는 6 탄소의 설탕이다녹는점이 96 °C 이고, 물에 녹으며, 밀도는 1.35 g/cm3[1]이다.d-알룰로스의 단맛은 자당의 70% 정도이다 [2].D-Allulose는 환원당이며 열처리 중 갈변 반응에 참여할 수 있습니다.D-allulose의 열량은 rat 실험에서 0.029 kJ/g으로 측정되었는데 이는 자당에너지의 0.3%로 D-allulose 가 거의 0의 에너지를 가지고 있음을 알 수 있다 [3-4].d-알룰로오스 (D-allulose)는 자연에서 매우 희귀하며, 식물 원천도 극히 드물다 [5].일부 박테리아에서도 소량의 알룰로오스가 발견되었으며 [6], 동물에서는 d-알룰로오스가 발견되지 않는다.알룰로스는 동물에서 발견되지 않았다.그러나 d-알룰로오스는 장기간 가열처리를 거친 과일주스 등 다양한 식품에서도 발견되며, 다양한 식품 중의 d-알룰로오스의 함량은 제조과정 중의 당농도, 온도 및 가열시간과 밀접한 관계가 있다 [2, 7].

체내 D-allulose의 생리적 기능과 대사 1.2

이D-allulose의 생리적 기능를 포함한다:식이 d-과당 및 d-포도당의 흡수를 감소시키고 [8-9];인슐린 저항성 향상 [7, 10-11];항 비만 활성 [12-14];그리고 혈중 지질 [15]을 낮춘다.쥐에서 d-알룰로오스의 대사 경로에 대한 연구에 따르면:1) 장 내 d-알룰로오스의 수송은 포도당 수송체 5에 의해 매개되며, d-프락토스에 대한 친화도가 낮다 [16-18];2) d-알룰로스는 글루코스 관련 대사에 관여하지 않는다 [19];3) d-알룰로오스는 동물의 간에서 대사될 수 없으며, 따라서 간 에너지 생성을 촉진할 수 없다 [20].d-알룰로오스의 약 98%는 경구 또는 정맥 투여 후 소변과 분변의 형태로 체내에서 배출되며 [21]맹장 내 미생물의 작용에 의해 소량의 d-알룰로오스만이 단사슬지방산으로 분해된다.

d-알룰로스의 응용 1.3

d-알룰로스는 2011년 미국 FD한로부터 일반적으로 안전한 것으로 간주되는 (GRAS) 제품으로 승인되었으며 [4, 7] 식품 성분 및 건강 보조제로 허용된다.연구에 따르면 d-알룰로스의 최대 섭취량은 하루 체중 kg 당 0.55 g 이며,이 범위 내의 사람에게는 설사를 일으키지 않는다고 한다 [8-9].

d-알룰로스는 낮은 칼로리, 높은 단맛 및 강력한 감소 특성으로 인해 식품 산업에서 넓은 시장 잠재력을 가지고 있습니다.예를 들어, d-알룰로스는 마야르 반응을 통해 계란 흰자 단백질의 특성을 우수한 겔 강도, 유화 안정성, 기포 특성 및 항산화 활성 등 종합적으로 개선할 수 있다 [22-23].또한 d-알룰로오스는 과발효로 인한 요구르트의 강한 신맛을 조절하며 발효유 제품의 품질을 향상시킬 수 있지만, 발효 균주의 프로바이오틱 활성과 그것이 발효 제품에 전하는 프로바이오틱 건강 혜택에는 영향을 미치지 않는다 [21].또한 제빵에 25%의 d-알룰로오스를 사용하면 다른 첨가물과 조합하면 무설탕 케이크를 만들 수 있다 [24].

d-알룰로스는 다른 분야에서도 광범위한 응용 가능성을 가지고 있습니다.예를 들어, d-알룰로오스 (d-알룰로오스)로 만든 식물성 소재는 영구적이고, 방수적이며, 환경친화적인 광소자 및 액정 디스플레이 [25]용 빛 전송 필름으로 사용될 수 있다.d-알룰로스는 또한 최초로 발견된 설탕 기반의 구충제이며, 기생충의 성장을 억제하는데 일부 긍정적인 효과가 있다 [26-27].또한 D-allulose는 다른 헥소스의 전구체이며 D-allose [28-29]의 생산에 대단히 중요한 역할을하고 D-allitol [30]은 대단히 중요한 역할을 한다.

2.생물학적 효소법 (Biological enzyme method)

d-알룰로오스의 화학 합성 방법은 분리시의 어려움, 많은 부산물, 화학 폐기물 발생 등 극복하기 어려운 공통적인 단점을 가지고 있다.따라서 친환경적이고 환경친화적인 생물학적 효소생산방법은 점차 세계적으로 광범위한 주목을 받고 있다.

2.1.1 DTEase 계열 효소의 공급원

d-타가토스 3-에피머라제 계열 (DTEases)은 C3위치에서 케토 단당류의 이성질화를 촉매하는 효소이며 [32]희귀당 생산을 위한 핵심 효소이기도하다.DTEase 계열의 효소로는 d-타가토스 3-에피머라제 (DTEases) [33], d-알룰로스 3-에피머라제 (DAEase) [35], 케토스 3-에피머라제 (ketose 3-에피머라제) [36] 가 있으며, 이들은 모두 d-과당을 d-알룰로스로 전환하는 촉매작용을 하는 공통된 특성을 가지고 있다.

유전자 암호화 DTEase는 클 로스cellulolyticum H10[37], Ruminococcus sp.[38], Clostridium scindens[34], Desmospor한sp.[35]에서 순차적으로 분리되었으나, d-알를로스의 산업적 생산을 위해 더 많은 원천과 더 효율적인 DTEase[32, 37, 39-40]를 아직 탐색할 필요가 있다.

DTEase의 효소의 특성 2.1.2

DTEase 계열의 효소 중에서 D-allulose-3-epimerase(DTEase) 가 D-fructose의 D-allulose 반응을 촉매하는데 가장 높은 효율을 보인다.C. cellulolyticum과 A. tumefaciens에서 제조한 DAEases의 촉매효율 (Kcat/Km)은 각각 186.4, 205 L/(mmol·min)으로 Clostridium sp. (141.4 L/(mmol·min)) 및 Ruminococcus sp. (51 L/(mmol·min)) [34, 37-38], 표 1을 참조.

금속 이온은 d-과당과 결합하여 고정되며 d-과당이 d-알룰로스로 전환되는데 결정적인 역할을 한다.Asp183과 His209잔기는 금속 이온을 통해 기질을 효과적으로 결합한다.DTEase 계열의 효소들은 금속 이온인 Mn2+, Co2+, Mg2+ [41, 44-45]에 대한 의존성의 정도가 상당히 다르다.그러나 C. cellulolyticum 으로부터의 DAEase와 C. scindens 로부터의 DTEase의 효소활성은 금속이온인 Mn2+와 Co2+에 엄격히 의존한다 [35, 37].

DTEase의 결정 구조 2.1.3

DTEase 계열 효소 중에서 A. tumefaciens와 C. cellulolyticum의 DAEases 가 테트라머와 가장 가까운 형태를 보인다.다이지 테트라머에서 두 소단위의 아미노산 잔기 사이에 34개의 수소 결합이 형성된다.DAEase의 높은 촉매 활성은 DTEase 계열 효소의 두 이량체 사이의 광범위한 상호작용에 의해 발생하는 넓은 계면 용매 접근 영역 (interfacial solvent-accessible area)에 기인한다 [42].또한, 재조합 균주에 의해 발현된 DAEase는 여전히 우수한 효소적 특성을 나타낸다.C. cellulolyticum H10에서 발현되는 다이즈의 이형 발현은 반감기가 더 길고, 운동 파라미터가 높으며 열 안정성이 높다 [37].

DAEase의 4차 배열은 4개의 동일한 소단위 A, B, C, d로 구성된 비대칭 단위이며 활성 부위는 금속 이온의 4잔기, 두 물 분자의 8 면체 조정 (octahedral coordination)을 포함한다.이 네 개의 소단위체는 소단위 A와 D 가 서로 상호작용하는 결정대칭 (dimers)에 관련된 것으로서, 소단위 B와 c에 모두 근접하여 다이지 (DAEase)의 활성부위가 다이머의 동일한 앞면에 노출되어 있다.이러한 안정적인 이량체는 이량체 (dimer)의 일면에 기판을 결합하기 위한 접근 가능한 우수한 표면을 제공한다 [16].

활성 부위의 소수성 홈과 접근 가능한 표면은 A와 B 하위 단위 사이에 위치합니다.DAEase의 하부 장치 측면은 닫혀 배럴 구조의 양 끝에 노출되어 있습니다.다이지 (DAEase)의 테트라머에서, 두 개의 다이머가 통 구조의 양 측면에 동봉되어 있다.각 모노 머 (아 단위 A, B, C와 D)으로 구성 된 8 단위 (β/α) 구조 물의 반복 합니다.각 량은 13 α로 이루어 져-helices과 8 명의 β-folds, 모노 머의 [16]의 주요 구조를 형성하다.

DTEase의 촉매 메커니즘 2.1.4

DTEase 계열 효소의 촉매 작용은 소단위의 분자 배열에 따라 달라진다.이들의 활성 부위는 효율적인 효소 반응을 얻기 위해 기질에 위치한다.Mn2+와 2개의 물분자와 4개의 아미노산 (Glu, Asp, His, Glu)은 팔면체 조화를 이루고,이 4개의 아미노산 잔기는 모든 ketose 3-epimerases에서 완전히 보존된다.A. tumefaciens의 DAEase와 P. cichorii의 DTEase에서 6가지 잔류물 (Glul50/Glul52, Aspl83/Aspl85, His209/His211, Glu244/Glu246, Glul56/Glu158, His185/His188)은 site-directed mutagenesis에서 기질결합과 열적 안정성에 중요하다.

기질이 물 분자를 대체한 후, 활성 부위는 이입체 이성화 과정을 거친다.두 잔기인 Glu50과 Glu244는 Mn2+와 협력하여 d-과당의 C3에 있는 양성자를 제거하여 d-알룰로스의 cis-diol 중간체를 형성하고, d-알룰로스는 다이즈 활성 부위의 수소 결합과 물 분자 사이의 위치에서 방출된다.

현재 촉매 활성과 열적 안정성을 향상시키기 위해 DTEase 계열의 효소에 대한 분자 개량이 수행되고 있다.D-allulose 생산시 Caldicellulosiruptor obsidiansis 로부터 L-rhamnose이성질체의 열안정성 및 촉매거동을 향상시키기 위해 Site-directed mutagenesis를 이용하였다.소수 성 β에 잔류 물을 1-α 1-loop 북극 아미노산과 함께 완전히 대체 될 수 있었다.야생형 효소와 비교하여 V48N/G59N/I63N과 V48N/G59N/I63N/F335S 돌연변이의 상대적 활성은 야생형 효소에 비해 각각 105.6%, 134.1% 높은 상대적 활성을 보인다 [57].또한 Site-directed mutagenesis는 Dore한sp. [50] 로부터 D-allulose-3-epimerase(DAEase)의 열 안정성을 향상시켰다.

DTEase 계열 효소의 촉매 메커니즘에 대한 연구는 아직 걸음마 단계이며, 효소구조와 촉매기능과의 관계에 대해서는 더욱 심층적인 연구가 필요하다.또한, DTEase의 열 안정성 및 기질 특이성은 아직 부족한 부분이 있습니다.희귀당 생산시 DTEase 계열 효소의 기질 특이성을 더욱 활용하여 기능성 희귀당의 효율적이고 친환경적인 생산을 달성해야 한다.

DTEase의 이형성 발현 2.1.5

대부분의 DTEase 계열 효소는 박테리아로부터 확인 및 분리되었으며, 자연 균주에서 발현되는 효소의 수는 응용 분야의 요구 사항을 충족시키기에는 턱없이 부족하다.따라서 발현벡터를 구성하여 이형생물에서 발현시키는 것은 특성화 연구와 효소학적 응용에 있어서 매우 중요하다.

Bacillus subtilis, Escherichi한coli 그리고 효모는 DAEase 발현을 위한 재조합 시스템을 구성하는데 일반적으로 사용된다.대장균과 달리 Bacillus subtilis는 외막이 없기 때문에 분비하는 단백질을 배양액으로 바로 내보낼 수 있다.또한 Bacillus subtilis는 식품급이며 분비하는 단백질에서 heat-labile lipopolysaccharides (내독소)를 분비하지 않습니다.조작된 박테리아 대장균 (Escherichi한coli, E. coli)은 명확한 유전적 배경, 완전한 벡터 수용체 시스템, 빠른 성장, 간단한 재배, 재조합 안정성 등의 장점을 가지고 있다.또한 효모발현 시스템은 배양조건이 간단하고 생장이 빠르며 발현 수준이 높고 조작이 간단한 특징을 가지고 있다.번역이 끝나면 단백질을 가공해 정확하게 변형할 수 있다.효모 발현 시스템의 단점은 낮은 복제 유전자 발현, 긴 발효 시간, 잘못된 단백질 당화, 세포 분열에 대한 저항성이다.또한, 초산물의 다당류 농도가 높으면 재조합 단백질의 정제에 도움이 되지 않는다.

초기 연구자들은 DTEase 계열 효소의 발현과 효소학을 연구하기 위해 대장균을 숙주 세균으로 사용하는 경향이 있었다 [34, 37].최근 많은 연구자들이 D-allulose의 생산을 위해 DTEase 계열의 효소를 발현시키기 위해 Bacillus subtilis와 효모를 숙주 세균으로 사용하고 있다 [35].A. tumefaciens의 DAEase 유전자는 재조합 후 E. coli와 K. marxianus에서 발현되어 알룰로스 생산에 사용되었으며, D-allulose의 생산량은 각각 230 g/L [53], 190 g/L [56]에 달했다.비교적으로 대장균 발현 시스템을 이용하여 A. tumefaciens에서 발현된 다ease 효소가 현재까지 가장 높은 발현 수준을 보였으며, 표 2에 나타낸 바와 같다.

(1) 대장균 발현 시스템:대장균 발현 시스템은 비용이 저렴하고 발현 효율이 높은 장점이 있습니다.DTEase 계열의 효소는 수용성 단백질로서 대장균에서 과발현 될 수 있다.재조합 DTEase 효소를 친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리 및 정제하고, d-알룰로오스의 수율은 120-218 g/L 이며, 전환율은 24~33%이다 [34].Agrobacterium tumefaciens 로부터 전세포 반응법을 이용한 재조합 대장균에서 발현된 다ease 효소의 수율과 전환효율은 각각 230 g/L 및 33%였다 [53].

(2) 바실러스 발현 시스템:다이지 코딩 유전자를 가지고 있는 재조합 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)는 다이지 효소를 고효율 저비용 방식으로 과발현 시킬 수 있다.음이온 교환수지 매트릭스에 고정화된 재조합 다이지 (DAEase)는 안정적이고 효율적인 알룰로오스 생산을 촉진할 수 있다.Bacillus subtilis B. subtilis에서 발현된 재조합 DAEase는 58.6 U/mg의 활성을 나타내어 대장균 (8.95 U/mg)보다 높은 활성을 나타내었다.또한 다이지 발현의 조절 요소는 효소의 양과 활성에도 영향을 미친다.Bacillus subtilis B. subtilis에서 벡터인 pma5-pxy/A-RDPE는 95 U/mL의 효소활성으로 DAEase를 안정적으로 발현할 수 있다.이 값은 pBluescript-SK-DTE vector를 가진 대장균 E. coli에서 발현되는 효소 활성보다 높다 [54].

3) 효모 발현 시스템:

외인성 DAEase 유전자는 재조합 S. cerevisiae [55]와 Kluyveromycesmarxianus[56]에서 높게 발현될 수 있다.A. tumefaciens의 DAEase 유전자를 전달하는 발현 벡터 pRS424-TEFpr-ss-xy/A는 S. cerevisiae AN120에서 상대 분자량이 33 000인 단백질을 발현시킬 수 있다 [55].T. thermophilus의 xylose isomerase유전자와 A. tumefaciens의 DAEase 유전자는 효모포자에서 공동발현되어 시너지 촉매작용을 증진시킨다.두 재조합 효소를 고정화하고 d-포도당을 기질로 사용하여 d-알룰로오스를 생산하였다 [55].재조합 자일로스 이성질화효소는 d-포도당을 d-과당으로 전환시키는 촉매제이며, 재조합 다브레스는 d-과당을 d-알룰로스로 전환시킨다.Yang 등은 재활용 촉매 방식으로 d-알룰로스를 생산할 수 있는 수정된 K. marxianus 세포를 재생하는 귀중한 접근법을 제공하였다 [56].재조합 K. marxianus는 750 g/L D-fructose의 기질 농도에서 12시간 이내에 190 g/L d-알룰로스를 생산하였고, 잔여 d-과당 약 100 g을 조작균에 의해 34 g의 에탄올로 전환하였다.또한 전세포 생체 분해로 d-알룰로스를 생산하는 방안도 제시되었다 [56].

d-알룰로스의 분리 및 정제2.2

d-알룰로오스의 분리 및 정제에는 주로 다음 두 가지 방법이 포함됩니다:첫 번째 방법은 이온 교환 수지입니다.음이온교환수지 매트릭스와 동시이동층 크로마토그래피를 이용하여 DAEase 효소를 고정시켜 D-fructose 로부터 D-allulose를 기질로 생산하였다.R. sphaeroides SK011세포는 이온교환수지 투석을 이용하여 초기 기질 농도인 50 g/L d-과당 (39) 으로부터 6.5 g/L d-알룰로스를 생산할 수 있으며, 0.82 g·h-1의 생산 속도를 가질 수 있다.d-알룰로스와 d-과당을 포함하는 혼합계의 경우, 먼저 d-알룰로스를 글루콘산으로 전환한 후 음이온교환수지 [57]에 의해 91.2%로 정제하였다.

두 번째 방법은 생물학적 방법을 이용하여 d-알룰로오스를 정제한다.d-알룰로스와 d-과당을 포함하는 혼합계에서 효모를 이용하여 남은 d-과당을 섭취하고 에탄올을 제조하여 d-알룰로스를 얻었다.또한, 삼투압 증발, 케이션 교환 크로마토그래피 및 생물학적 방법을 병행하여 d-알룰로스를 분리 및 정제하였으며, 순도는 최대 86.2% [58]였다.

3 토론

D-Allulose는 D-fructose의 C-3 epimer로 많은 생리적 기능을 가지고 있으며 식품, 의약품 및 건강 관리에 널리 사용됩니다.미국 FDA 가 2019년 4월 알룰로스를 첨가당 및 총당 집계에서 제외하는 우대조치를 통과시킨 이후 주요 기업들이 알룰로스에 큰 관심을 갖기 시작했다.현재, 이world's는 D-allulose의 주요 생산업체로, South Korea's CJ CheilJedang, the UK's 테이트 &Lyle과 Japan's Matsutani 군, 모두 생물학적 방법을 사용하여 d-알룰로스를 생성한다.따라서 d-알룰로스의 생산을 촉매할 수 있는 유전자 조작 박테리아의 제조는 d-알룰로스의 산업화를 위한 중요한 토대가 된다.비록 알룰로오스는 현재 몇몇 국가에서만 합법적으로 사용될 수 있지만, 의심할 여지 없이 미래에 주요 감미료가 될 것이다.

d-알룰로오스에 대한 생물학적 효소법 연구, 특히 유전자 채굴 및 세포 구축 기술의 급속한 발전으로 획기적인 발전이 있었지만 d-알룰로오스의 생물학적 생산에 대한 산업적 전망은 여전히 불확실하다.후속 연구는 다음의 두 가지 분야에서 수행될 수 있다:1) 유전자 마이닝 방법을 통해 높은 활성과 안정성을 갖는 DTEase 계열 효소를 스크리닝하고, 효율적인고 처리량 스크리닝 방법을 확립하며, 산업화의 요구에보다 부합하도록 DTEase 계열 효소를 분자적으로 변형하여 d-프럭토스와 d-알룰로오스의 효율적인 전환을 달성한다;2) d-알룰로오스의 산업적 제조는 효소 촉매 후 혼합물 내 잔류 d-과당의 제거 문제에 직면하기 때문에, d-알룰로오스의 분리 및 정제는 생산 비용을 증가시킨다.현재 d-알룰로스의 분리와 정제 및 결정화에 대한 연구가 상대적으로 적어 하류 산업화가 상대적으로 뒤처져 있음을 알 수 있다.분리 및 정제, 결정화, 건조 및 기타 공정 단계 등 하류 공정 단계를 단순화함으로써 d-알를로오스의 산업 생산 비용을 더욱 절감하고 d-알를로오스의 생산 효율성을 향상시킬 필요가 있다.

그림 1은 D-allulose [16]에 대해보다 진보된 친환경 및 재활용 가능한 공정 기술을 보여준다.전체 반응계는 생물반응기 A (자크로스 가수분해 및 d-알룰로오스로의 효소전환을 위해)와 생물반응기 B (에탄올 생산, d-알룰로오스 분리 및 효모 전파를 위해)로 나뉜다.원사탕수수즙이나 단수수즙은 자당을 생산하는 원료로 사용된다.사용된 조작효모에는 천연 수크로스 이성화효소와 재조합 외인성 DTEase 계열 효소 유전자가 포함되어 있어 조작효모는 수크로스를 수크로스 이성화효소로 가수분해함으로써 d-포도당과 d-과당을 생산할 수 있다.d-과당은 55~60 °C에서 DTEase 계열 효소에 의해 d-알룰로스로 전환되고, 남은 d-포도당과 d-과당은 27~30 °C에서 발효되어 에탄올을 생성하고, 에탄올을 모아 연료로 사용할 수 있다.이 방법의 장점은 낮은 원료 비용, 가능한 한 공정 중에 생성되는 중간 제품 사용, 번거로운 분리 및 정화 단계의 감소뿐만 아니라 폐기물 형성의 감소, 낮은 에너지 소비 및 높은 당 수율입니다.

4 전망

현재 D-allulose는 산업적으로 중국, 일본, 한국, 미국 및 영국에서 톤 수준에서 생산되고 있다.치열한 산업 경쟁에서 두각을 나타내기 위해서는 d-알룰로스를 생산하는 기업들이 공정에서 각 링크의 기술을 향상시켜야 한다.현재 주요 생산 장벽은 이성질체의 낮은 활동성과 낮은 전환율, 낮은 재사용 빈도이다.따라서 효소 활성, 안정성 및 촉매 효율을 향상시키는 것이 향후 DTEase 계열 효소의 연구 및 개발의 핵심 목표가 되어야 합니다.d-알를로오스의 생산 비용은 탈색, 담수, 결정화 및 건조 공정을 개선하여 절감 할 수 있습니다.효율적인 high-throughput screening 기술을 이용한 비합리적인 공정의 합리적 설계 또는 수정은 DTEase 계열 효소의 구조를 변화시키는 직접적인 방법이다.DTEase 계열의 효소를 개선하고 생산 공정을 개선함으로써 d-알룰로오스의 생산 비용을 절감하고 가격을 낮출 수 있어 d-알룰로오스가 소비자에게 쉽게 공급될 수 있도록 보장합니다.

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