발효법으로 히알루론산 분말을 생산하는 방법은?

히알루론산 (HA)1934년 Meyer와 다른 이들에 의해 소의 유리유머로부터 처음으로 분리, 정제된 거대분자 다당류이기 때문에 다른 이름인 히알루로난 [1]이 되었다.루 론 산은 homogeneously 반복 한 선형 글 다당류로 이루어 져 25, 000 이당 류의 glucuronic 산으로 2, 000과 N-acetylglucosamine 번갈 아가 며 β-1에 묶여 3 당 결합과 β-1, 4 당 결합 [2].

히알루론산은 세포외기질 (ECM) [1]의 중요한 성분이다.최근 연구에 따르면 히알루론산은 세포 사이의 세포 밖 기질에 널리 존재할 뿐만 아니라 세포 내부에도 존재하며, 주로 신생세포의 세포질과 핵에 집중되어 있다 [2].히알루론산은 유리체에서 발견되는 것 외에도 관절의 활액이나 표피세포 사이의 공간에도 풍부하다.히알루론산은 양적으로 보면 50% 이상이 피부의 진피와 표피에서, 35% 정도는 근육과 뼈에서 발견된다.그것은 현재 그렇게 여겨지고 있다루 론 산연질 결합 조직의 불활성 공간 필러에서 주로 발견되며, 단백 단백질 복합체 [2] 형성에 중요한 역할을 한다.

히알루론산의 성질 1

전자 현미경으로,히알루론산 분자선형의 단일 사슬 구조를 가지고 있는 것으로 관찰되며, 수용액 속에서 임의의 코일 구조로 확장되며, 코일 직경은 약 500 nm이다.히알루론산 분자의 각 이당류 단위체에는 카르복실기가 포함되어 있으며, 생리적 조건에서 해리하여 음이온을 형성할 수 있다.같은 공간 거리에 있는 음이온들 간의 상호 반발력으로 인해 분자는 수용액 속에서 많은 공간을 차지하면서 느슨하게 확장된 상태가 되기 때문에 [3] 물 속에서 자기 무게의 1,000배 이상을 결합할 수 있다.

출처에 따라히알루론산 (hyaluronic acid) 추출법, 그것의 상대 분자 질량 (Mr)은 8×105에서 5×106[4]이다.히알루론산의 구조와 생물학적 활성은 상대적인 분자 질량에 의존한다.저분자 히알루론산은 저농도에서 파편화된 네트워크를 형성하고, 고분자 히알루론산은 완전한 네트워크를 형성한다 [3].

분자 내의 수소 결합으로 인해,히알루론산 분자수용액 [5]에서 단일 나선 구조를 채택한다.용액 속의 히알루론산 농도가 일정 수준에 도달하면 히알루론산 분자들이 서로 상호작용하여 이중나선 구조를 형성하며, [3] 고농도에서 네트워크 구조가 형성된다.현재 받아들여지고 있는 히알루론산 구조 이론은 3차 구조 이론으로, 히알루론산 분자 내의 각 삼당류 단위는 소수성 영역을 가진다는 것이다.용액 농도가 높으면 히알루론산 분자의 소수성 영역이 상호작용하여 이중나선 구조를 이루고, 이것이 히알루론산 분자가 뭉치는 기초가 된다 [6].

루 론 산매우 높은 점도 [2] 가 특징이다.낮은 농도나 낮은 상대 분자 질량에서는 농도나 Mr이 증가해도 용액의 점도는 거의 변하지 않는데, Mr과 농도 증가 후 점도가 10 mPa·s에 도달하면 히알루론산 분자들이 얽히기 시작하며,이 때 Mr과 농도가 증가할수록 점도가 급격히 증가한다 [3].

히알루론산 파우더의 생산 기술 2

히알루론산 분말의 생산 기술은 추출, 미생물 발효, 합성 등 3가지가 보고되어 있다 [1].

그 추출법은히알루론산 추출사람이나 동물의 조직 [1]에서 나온다.추출 방법은 히알루론산을 생성하기 위해 처음으로 사용된 방법이었습니다.현재 생산에 사용되는 주요 원료는 닭빗과 사람의 탯줄, 동물의 눈이다.주요 공정 단계는 추출, 불순물 제거, 효소 가수분해, 강수 및 분리를 포함합니다.조직마다 히알루론산에 대한 추출 및 정제 과정이 어느 정도 다르다 [3].그러나 추출 방법의 원료 공급처가 한정되어 있어 제품 추출률이 극히 낮고 (약 1%에 불과함), 공정이 복잡하여 생산 비용을 절감하기 어렵다.또한 히알루론산은 동물 조직 내 다른 고분자 물질과 결합되기 때문에 분리 및 정화가 더욱 어렵고, 동물 조직에서 추출한 히알루론산 생성물은 감염을 유발할 수 있다.이러한 요인들은 의약품과 화장품 [2, 3]과 같은 산업에서 추출법을 광범위하게 적용하는 것을 제한한다.

합성 방법은 먼저 a를 합성하는"히알루론산 옥사지리딘 유도체"생물학적인 대분자를 이용한 다음, 양이나 소의 고환에서 물과 히알루로니다제를 첨가하여 유도체와 효소의 복합체를 준비하고, 마지막으로 효소를 제거하여 히알루론산을 정제한다 [1].합성 방법은 아직 실험실 연구 단계에 있으며 [1] 공업 생산에는 아직 적용되지 않았다.

미생물 발효법은 걸러진 세균을 이용하여 발효 및 배양을 진행하는 것을 말하며, [1] 발효 국물에서 히알루론산 생성물을 분리, 정제하여 얻는다.추출 방법의 위의 단점과 합성 방법이 아직 성숙되지 않았다는 사실로 인해 미생물 발효 방법은 위해하는 가장 중요한 방법이되었습니다히알루론산을 생산합니다다.다음은 히알루론산 분말을 생산하기 위한 미생물 발효법을보다 체계적으로 정리한 것이다.

히알루론산 생성 박테리아의 번식 2.1

가장 먼저 발견된 미생물히알루론산 (hyaluronic acid)을 생성합니다1937년에 히알루론산 [7]을 생산할 수 있다는 것이 발견된 연쇄상구균 표게네스였다.이어서 1939년에 Streptococcus equisimilis와 S. zooepidemicus도 히알루론산을 생성할 수 있다는 것이 발견되었다 [7].야생형 연쇄상구균은 히알루론산을 생성할 수 있기 때문에,  equisimilis)와 Streptococcus zooepidemicus (S. zooepidemicus)도 히알루론산을 생성할 수 있음이 밝혀졌다 [7].

야생형 연쇄상구균은 히알루로니다제 생성 능력, 다른 세포 밖 단백질 발현 능력 등의 단점이 있기 때문이다낮은 히알루론산생산 [2], 야생형 계통은 산업생산의 요구에 부응하기 위하여 실제 생산에서 다양한 방법으로 변형되어야 한다.

2.1.1 돌연변이 생성 번식

돌연변이에는 주로 물리적돌연변이, 화학적돌연변이, 생물적돌연변이 등이 포함된다.현재,의 번식에 사용되는 돌연변이히알루론산 생성 균주주로 자외선을 포함, 60Co γ 광선과 nitroguanidine (NTG) [7].Streptococcus zooepidemicus, Streptococcus equi와 같이 히알루론산을 생성할 수 있는 일부 원균주를 다양한 돌연변이 처리로 처리함으로써, 히알루론산 생성이 높거나, 상대적으로 분자량이 높은 히알루론산을 갖는 우수한 균주 또는 히알루로니다제 전 처리 후 음성반응, 또는 비용혈성, 또는 상기 특성을 조합한 균주를 얻을 수 있다는 연구 보고가 많다 [7].

원형질 배양 2.1.2

protoplasts 세포벽이 없기 때문에 일반 세포보다 환경 조건의 변화에 민감하고 돌연변이 치료 [7]에 더 강하게 반응한다.NTG와 같은 화학적 돌연변이나 레이저와 같은 물리적 돌연변이를 이용하여 원균주의 원형을 처리하여 고수익의 균주를 얻는 실험이 성공적으로 수행되었다 [7].

유전공학육종 2.1.3

에 관련된 효소를 암호화하는 유전자히알루론산 합성연쇄상구균에서의 경로 (pathway)는 하나의 역전사효소 (reverse transcriptase)에 위치하며 has operon 이라고 불린다.Streptococcus pyogenes에서 has operon은 히알루론산 합성효소 (42.0 U)를 암호화하는 hasA (1248 bp), UDP-glucose dehydrogenase (47.0 U)를 암호화하는 hasB (1204 bp), UDP-glucose pyrophosphorylase (33.7 U) [2]를 암호화하는 hasC (915 bp)의 세 유전자로 구성되어 있다.히알루론산 사슬이 어떻게 세포막을 통과하여 운반되는지는 아직 명확히 밝혀지지 않았지만, 엔테로코쿠스 페칼리스 (Enterococcus faecalis), 대장균 (Escherichia coli), 바실루스 아틸리스 (Bacillus subtilis)에서 히알루론산 합성효소 (hyaluronic acid synthase)와 UDP-glucose dehydrogenase의 발현이 히알루론산 생성과 수송을 지시하기에 충분하다 [2].따라서 hasA와 hasB 유전자를 숙주세포에 옮겨 숙주세포에서 발현시키는 것으로 간단하게 히알루론산을 생산할 수 있다 [7].

Streptococcus agalactiae group A의 점액가스 균주 S43/192/4의 HA 합성 유전자를 1993년에 처음으로 클로네이트하여 대장균 플라스미드로 제작하였고, 대장균에서 성공적으로 발현하여 HA를 합성하였다 [8].이어서 1997년 Streptococcus agalactiae group C의 HA 합성 유전자가 복제되어 대장균에 발현되었다 [8].

Ling Min 등 9)은 Streptococcus equi subsp의 전체 DNA 로부터 sqhas 유전자를 증폭시켰다.으로 건설 된 zooepidemicus plasmid 및 변환 식 대장균 DH5 α, sqHAS 단백질을 성공적으로 표명 했고, 합성 되어 HA 기질의 존재에 있다.장진유 등은 Streptococcus zooepidemicus의 hasB 유전자를 복제하고 이를 대장균에 발현시켜 해당 단백질을 얻었다.

중국 대만의 Chien research group은 NICE inducible expression system을 통해 Streptococcus zooepidemicus의 hasA와 hasB 유전자를 Lactococcus lactis에 도입하여, 이를 조작한 균주를 얻는 데 성공하였습니다히알루론산을 생성합니다[11].

현주유 [12]는 NICE (nisin-controlled gene expression system) inducible expression system을 통해 Streptococcus zooepidemicus hyaluronan synthase 유전자를 Lactococcus lactis에 도입하여 성공적으로 발현시켜 HA를 합성하였다.

발효 조건의 최적화 2.2

연쇄구균은 영양소가 풍부한 매체로 성장해야 하는 까다로운 영양요구량을 가진 세균이다.연쇄구균은 보통 효모 또는 동물 추출물, 펩톤 및 혈청의 혼합물을 포함하는 복합 매체에서 자란다.이러한 매체의 제형에는 항상 포도당 (10~60 g/L), 아미노산, 뉴클레오티드, 다량의 소금, 미량 미네랄과 비타민 [2]이 포함되어 있다.

pH와 온도는 Streptococcus zooepidemicus와의 성장에 매우 중요하다히알루론산 (hyaluronic acid) 생산다.일부 연구에 따르면 pH 6.7 ± 0.2, 온도 37 °C의 조건이 연쇄상구균의 생장과 히알루론산의 생성에 가장 적합하다고 한다 [13].휘젓는 속도는 히알루론산의 생성에도 영향을 미친다.연구에 따르면 동요율이 낮은 조건에서는 젖산 생성이 높고 히알루론산 생성이 낮다 [13].고속 동요는 젖산 합성의 효과를 줄이고 히알루론산 생성을 증가시킬 수 있지만, 히알루론산 중합체를 파괴하고 상대적인 분자 질량을 감소시킬 수도 있다 [13].초기 포도당 농도는 히알루론산의 상대 분자 질량에 상당한 영향을 미칩니다.연구에 따르면 초기 포도당 농도가 20 g/L에서 40 g/L로 증가하면 히알루론산의 상대 분자량도 (2.1±0.1)×106에서 (3.1±0.1)×106 [13]으로 증가한다.

Liu 등 14)은 Streptococcus zooepidemicus를 회분식 발효하는 동안 과산화수소 (1.0 mmol/g HA)와 아스코르브산 (0.5 mmol/g HA)을 각각 8 h와 12 h에 첨가하여 산화환원을 유발하였다고 보고하였다히알루론산의 탈중합, 상대적인 분자량이 감소하고 수율이 5.0 g/L에서 6.5 g/L로 증가하였다.

히알루론산을 응용한 3가지

많은 사람들 때문에히알루론산의 성질위에서 언급했지만, 여러 분야에서 널리 사용되고 있다.다음은 주로 화장품, 건강 제품 및 의료 및 제약 분야에서 히알루론산의 응용을 요약합니다.

3.1 히알루론산을 화장품에 적용

루 론 산주로 세포사이의 세포외기질에서 발견되는데, 조직세포의 세포외공간을 유지하고, 영양소의 흐름을 가속화하며, 조직을 유지하는 기능을 가지고 있다.우선 기존 보습제와 비교해 히알루론산이 보습효과가 더 좋고 기름기가 없어 모공을 막지 않는 장점이 있다.둘째, 히알루론산 수용액은 점탄성과 윤활성이 강하여 피부 표면에 통기성이 좋은 보습막을 형성하여 피부를 촉촉하게 유지하는데 도움을 준다.셋째, 작은 분자의 히알루론산이 진피에 들어가 혈액 미세순환을 촉진하고 피부의 영양분 흡수를 도와 미용과 건강 증진 효과를 볼 수 있다.마지막으로 히알루론산은 자외선으로 인한 피부 내 활성산소 활성산소를 제거하여 자외선 차단 및 회복 [15]을 할 수 있다.

많은 사람들 때문에히알루론산의 장점, 그것은 보습, emollient, 안티 주름 및 자외선 차단을위한 이상적인 천연 보습 인자로 화장품에 널리 사용됩니다.통상 첨가량은 0.05%~0.50% [15].

보건품에 히알루론산 적용 3.2

이후로히알루론산은 다양한 성질을 가지고 있습니다수분 유지, 윤활 작용, 상처 치유 촉진, 세포 보호 등 신체 내 히알루론산이 감소하면 관절염, 피부 노화, 주름 증가 등 많은 문제가 발생할 수 있다.따라서 내인성 히알루론산을 보충하기 위한 히알루론산의 경구 보충은 현재 미용과 건강 유지 및 수명 연장에 효과적인 방법 중 하나로 여겨지고 있다 [16].

에 대한 이론적 근거구강 히알루론산경구 소화 후, 히알루론산이 체내에서 히알루론산의 합성을 위한 전구체를 증가시켜 체내에서 합성되는 히알루론산의 양을 증가시키고 피부와 같은 조직으로 목표하여 그 효과를 발휘할 수 있다는 것입니다.현재 정제와 캡슐, 경구용 액체 [16] 등 다양한 경구용 히알루론산 제품이 출시되고 있다.

3.3 히알루론산의 의학적 치료 적용

히알루론산은 널리 사용된다독특한 점탄성, 생체적합성, 비면역원성 [17]으로 인해 안과, 정형외과 등 많은 의료 분야에서.

눈 질환의 경우, 선호되는 치료 경로는 국소 안과 투여입니다.안과 약물의 경우 약물의 생체 이용성은 일정 범위 내에서 액체의 점도와 양의 상관관계가 있습니다.점도를 높이면 약물의 눈 속 거주 시간을 연장시켜 효능을 향상시킬 수 있다.하지만 일부 점도강화제는 눈이 불편해지는 등의 부작용을 일으킬 수 있다.히알루론산은 뉴턴이 아닌 유체 특성과 좋은 생체 적합성으로 인해이 단점을 극복합니다.따라서 개발 및 적용할 가치가 있는 좋은 안과용 의약품 점안제이다 [18].히알루론산은 안약에 사용되는 것 외에도 안구건조증 치료에도 사용할 수 있다.현재 히알루론산은 안구건조증 [19]을 개선하기 위해 다른 다양한 고분자 화합물과 함께 사용되고 있다.

히알루론산은 유리체내에 존재하는외에 관절연골과 활액의 주성분이기도하다.우리 몸에 골관절염, 류마티스 관절염 등 관절질환이 생기면 관절 내 히알루론산의 생성과 대사가 이상해지고, 활액내 히알루론산의 농도와 상대 분자량이 현저히 감소해 연골 분해를 방해한다.이로 인해 관절 질환을 치료해주는 점탄성 보완요법이 개발되었다외인성 히알루론산을 보충합니다다.이 요법은 효과가 오래 지속되고 부작용이 거의 없기 때문에 [20] 의사와 환자 모두에게 점점 인기를 끌고 있다.

또한, 히알루론산은 다양한 운반체 (항암 표적 약물 운반체, 유전자 치료를 위한 비 바이러스 매개체, 운반체 등) 로서 약물 전달 시스템에도 널리 사용됩니다펩 티 드및 단백질 약물), 수술시 임플란트 재료로서, 그리고 재발성 구강 궤양 [17]의 치료에 사용된다.

4 전망

히알루론산이 점차 다양한 분야에 응용됨에 따라, 생산을 위한 미생물 발효법히알루론산 파우더추출 방법을 점차 대체하여 히알루론산의 공업 생산을위한 주요 방법이 될 것입니다.외국 숙주에서 히알루론산 생산이 시작되었다는 것은 히알루론산 생산이 현대 생명공학을 응용하는 단계에 접어들었음을 의미한다.향후 다양한 상대 분자 질량을 갖는 히알루론산을 생산할 수 있는 균주를 선발하고, 지속적인 발효 조건의 최적화를 통해 다양한 분야에서 사용될 수 있는 히알루론산 제품을 제공할 예정이다.또한 히알루론산은 여러 분야에서 점점 더 널리 사용될 것이다.

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