Mogroside V의 바이오 합성에 관한 연구

감미료는 식품 첨가물의 한 종류이다.원료에 따라 합성감미료와 천연감미료로 나눌 수 있다.천연감미료는 화학구조와 성질에 따라 당류와 비당류로 더 나눌수 있다.최근 연구는 합성 감미료가 장내 균형의 불균형과 포도당 불내증을 유발하여 대사 장애를 일으킬 수 있다고 지적하였으며 [1], 환경 오염을 일으키는 새로운 유형의 오염 물질이 되었다 [2];당의 많은 섭취는 충치, 비만, 당뇨병, 대사증후군 및 심혈관 질환 [3-5]의 발생에 기여하는 반면.식물 유래 천연 무당 물질은 높은 단맛 [6], 낮은 칼로리 [7], 안전성 [8], 카리오젠성 [9].부족 등으로 인해 단맛에 대한 갈망을 충족시킬 수 있는 신세대 감미료로서 관심을 끌고 있다.

현재 국내외에서 개발되어 이용되고 있는 주요 천연 무당 감미료는 Thaumatin, steviol glycosides, Mogrosi드(모그로사이드), glycyrrhizicacid[6](표 1) 이며, 그 중 가장 단맛은 Thaumat에서이지만, 쓴 맛과 감초류의"off-flavor"를 나타내며, 단맛이 지연되고 지속시간이 지나치게 길다는 단점이 있다 [17];두 번째는 몽크 과일 감미료로, 뒷맛이 불쾌하지 않고 [14]지방을 줄일 수 있는 유일한 완전 천연 감미료이다.Mogroside V(M5)는 모그로사이드 [18]의 단맛의 주 원천이다.1/10,000의 농도에서 단맛 값은 자당 5%의 425배이다 [19].또한 기침이나 가래를 경감시키는 작용 [20], 항암 작용 [21~22], 산화 방지 작용 [23]등 많은 약리작용을 가지고 있어 세계 각국에서 개발되고 있는 차세대 기능성 감미료이다.Luo 한강궈[25]를 재배하는 데 많은 어려움이 있고, 전체 과일 중 M5의 함량이 0.8%~1.3% (W/W) [26]에 불과하기 때문에 유사체의 복잡한 산물을 정화하는 것이 어렵고, Luo H한Guo에서 추출하는 것에 의존해서는 대규모 생산을 이루는 것이 불가능하다.

식물 세포 배양 [27], 대사 공학 [28], 합성 생물학 [29]의 발전은 천연 식물 산물의 획득을 위한 지속 가능한 생산 아이디어를 제공했다.식물세포배양은 원가가 높고 시간이 오래 걸리며 생산량이 적어 특수한 천연물을 생산하는데 사용하기 어렵다.또한, 식물 세포의 복잡성과 유전적 도구 및 적절한 방법의 부족으로 인해 식물 세포의 대사 공학은 여러 단계의 생합성 경로를 필요로 하는 복잡한 천연 생성물 M5의 생산에 어려움을 겪고 있다 [30].따라서 식물세포배양 및 대사공학은 M5의 대규모 생산에 실행 가능한 방법이 아닐 수 있다.합성 생물학 (合成物學, 영어:Synthetic biology)은 최근 생명 시스템 및 과정 [31]을 재설계, 엔지니어링, 구성, 적용하기 위해 등장한 과학이다.

전통적인 방법과 비교해 주기가 짧고 생산량이 높으며 안전성과 오염이 없고 추출 공정이 간단한 장점이 있다.친환경적이고 효율적인 새로운 생산 모델이다.합성 생물학 연구의 지속적인 발전과 Luo 한강궈[32]의 mogrosides의 분자 생합성 메커니즘에 대한 심층적인 이해로, M5를 합성하기 위해 미생물을 사용하는 것은 대규모 생산의 새로운 방법이되었으며, 이는 천연 감미료에 대한 소비자 수요를 충족하는 데 있어 매우 중요하고 넓은 전망입니다.본 논문은 M5의 생합성 메커니즘과 합성생물학 연구 진행 과정을 살펴보고, 미생물 합성에서 직면하는 어려움에 대해 논의함으로써, M5의 생합성 연구에 참고자료를 제공하는 것을 목적으로 한다.

Mogroside V의 구조 및 약리 학적 활성 1

시레이티아 그로스베노리과 (Siraiti한grosvenorii)는 쿠쿠르비타과에 속하는 시레이티아 그로스베노리식물의 익은 열매이다.폐를 촉촉하게 하여 기침을 멎게하고, 피를 차갑게 하며, 장을 촉촉하게 하여 장운동을 촉진시키는 효능이 있어 [33]중국에서 흔히 쓰는 한약재로 쓰인다.주요 활성 성분은 단 글리코사이드 [34]이다.연구진 [19, 35-36]은 Siraiti한grosvenorii에서 다양한 달콤한 글리코사이드를 분리하고 확인하였으며, 그 기본 구조는 그림 1에 나와 있다.포도당 단위의 개수와 연결 방식에 따라 맛이 상당히 다른 감미료 분자가 생성되는데, 이당류인 감미료 IIE는 굉장히 쓴 맛이 나는 반면, 오당류인 M5는 굉장히 단 맛이 난다 [37].

M5는 Luo 한강Guo 감미료의 구성 요소입니다단맛과 함량 [38]이 가장 높다.다케모토 츠네마츠 (Takemo을tsuematsu) [39-41]와 같은 일본 학자들에 의해 처음으로 분리되었으며, 아글리콘의 구조는 분광학적 방법으로 tetracyclic triterpenemomordinol로 확인됨으로써 M5의 완전한 구조를 구축하였다.M5의 분자식은 C60H102O29 이며, 이는 C3와 C24위치에서 momordinol에 포도당 단위를 첨가하여 형성된다.R2는 두 pyranose 단위로 연결 되어 한 마리의 β-1, 6-glycosidic 본드, R1은 진출 3-glucopyranosyl 그룹 β-1로 연결, 6-glycosidic 채권과 β-1, 2-glycosidic 채권이다.

식물 유래의 천연 무당 감미료는 종종 여러 가지 약리학적 활성을 나타낸다 (표 1). M5는 기침과 가래를 완화시키고, 항암, 산화 방지, 혈당을 조절하는 등 많은 기능을 가지고 있다.연구 결과 기침을 완화시키는 뤄한구오의 활성 성분은 부피 기준으로 50% 알코올 추출물이며, 분리된 M5는 쥐의 기침 횟수를 현저히 줄이고, 기침 대기 기간을 연장시키며, 기관지 내 페놀레드의 배출을 현저히 증가시켜 일정한 거담 효과를 나타내는 것으로 나타났다 [20].M5는 여러 생물학적 표적을 표적으로 하여 췌장암 세포의 증식과 생존을 억제할 수 있으며 [21], 이는 췌장암 이종이식물의 생쥐 모델에서 확인되었다.7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA), 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) 및 peroxynitrous 산(ONOO-)는 정상 세포의 종양 세포로의 전환을 유도하는 발암 물질입니다.M5는 쥐의 피부 발암실험에서 발암물질을 길항시켜 정상세포가 피부암세포로 변하는 속도를 늦추는 것으로 밝혀졌는데 [22], M5가 화학적 발암물질로 인한 피부암을 예방하는 효과가 있다는 것이다.M5 및 11-o-모그로사이드 V는 반응성 산소 종 (O2-·, H2O2 및 ·OH)을 현저히 제거하고 산화적 DN한손상을 억제할 수 있습니다.반면 11-o-모그로사이드 V는 M5보다 O2-· 및 H2O2에 대한 청소효과가 높지만, M5가 ·OH에 대한 청소효과가 더 좋다 [23].M5가 인슐린종 세포인 RIN-5F에서 인슐린 분비를 유도할 수 있다는 것을 발견하여 당뇨병 환자의 세포수준에 대한 M5의 혈당 조절 효과를 밝혔다.이 연구는 Luo Han Guo 추출물, 특히 M5가 제2 형 당뇨병 [24]을 예방하고 치료할 수 있는 가능성을 시사한다.

2. Mogroside V의 생합성 메커니즘 연구

합성생물학은 미생물 세포 [29]에 존재하는 생합성 경로를 재구성하여 원하는 제품을 생산하는 미생물 세포 공장을 확보하여 목표 화합물의 대규모 생산을 달성하는 것이다.따라서 Luo Han Guo에서 M5 합성의 분자 메커니즘을 명확히 하는 것은 합성 생물학을 이용하여 세포 공장을 건설하고 체외 합성을 달성하는 데 기초를 마련할 것입니다.

2.1모그로사이드의 축적 패턴

Mogroside의 축적 패턴을 이해하는 것은 M5 합성의 분자 메커니즘의 더 나은 분석에 도움이됩니다.Luohanguo 개발 중 Mogroside의 축적 패턴에 대한 연구 결과, Mogroside의 순 함량은 보존, 즉 성장 과정 내내 Mogroside의 총 함량은 변하지 않는 것으로 나타났다 [42].과실 발생 초기 단계에서 당질은 주로 Mogroside IIE의 형태로 R1과 R2는 모두 단당류 그룹이다.이 있 음을나 타 냅 glycosides의 glycosylation는 초기 단계는 두 기본 glycosylations, 후 두 번 째 glycosyl 그룹은 R1과 연결 되어 있 는데, β-1에 의해 6-glycosidic 본드, 결과의 축적에 mogrosideIIIX다.나중에 무대 (77 개화 된 후, d), tetrasaccharide 제품의 큰 숫자나 타 났 는데, 주로 sialenoside (Siamenoside)에 의해 형성 되는 나뭇가지 R1에는 β-1인, 6-glycosidic 본드와 β-1, 2-glycosidic 본드사당류 생성물의 섭취는 개화 77일 후부터 시작되었으며, 2개의 당보습제를 함유한 R2 M5의 축적이 성숙 마지막 단계에서 급격히 증가하였다.꽃이 핀 후 성숙한 과실 103 d의 달콤한 글리코사이드의 주성분은 M5이다.모그로사이드의 축적 패턴을 보면 M5의 생합성 경로는 모그로사이드가 먼저 C3와 C24위치에서 1차 당화를 거친 후 [32]이를 바탕으로 분지형 당화가 수행된다는 것을 알 수 있다.

2.2 Mogroside V생합성 경로 분석

전사체 및 대사체 분석은 식물 천연물의 생합성 경로를 해명하는데 효과적인 전략이다 [43].2016년 이스라엘 연구진 Itk에서et알다.[32]은 Luo Han Guo의 전사체 및 게놈 데이터를 기반으로 M5 생합성 경로를 완벽하게 분석하는 데 성공했다 (그림 2). M5 생합성 경로는 대략 세 단계로 나눌 수 있다:상류 전구체 합성 단계, 중류 골질 형성 단계, 하류 모핵 생산 및 변형 단계.

2.2.1전구체인 IPP와 DMAPP의 합성

테르펜 합성을 위한 상류 전구체로는 이소펜테닐피로인산염 (isopentenyl pyrophosphate, IPP)과 디메틸알릴피로인산염 (dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)이 있다.식물에서 IPP와 DMAPP의 생합성을 위한 두 가지 다른 경로가 있다:mevalonic 산경로 (MV한경로)와 mehyl-erythritol phosphate 경로 (MEP 경로).다양한 경로의 선택은 합성 생성물의 종류와 세포 하부 공간 위치 [45]에 따라 달라진다.MEP 경로는 plastide [46]에서 monoterpenes,diterpenes, tetraterpenes의 합성에 주로 사용되며, MV한경로는 세포질 [47]에서 sesquiterpenes, triterpenes, polyterpenes의 합성에 주로 사용된다.그러나이 둘은 완전히 독립적인 것은 아니며, 일반적인 중간 IPP는 plastid 막을 통해 서로 사용할 수 있다 [48].

M5는 세포질 내 triterpene sapon에서생성물이며, 전구물질인 IPP와 DMAPP은 MV한경로를 통해 acetyl coenzyme 한로부터 생성된다.먼저 아세틸 코엔자임 A의 두 분자는 아세틸 코엔자임 A 티오에스터라제 (ATOT)와 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A synthase(HMGS) 로부터 형성되어 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A (HMG-CoA)를 형성합니다.그런 다음, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR)의 촉매 작용으로 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (MVA) 가 형성되며, 이는 methyl-D-erythritol-4-phosphate kinase (MK), methyl-D-erythritol-3-phosphate kinase (PMK) 및 methyl-D-erythritol-3-phosphate decarboxylase (MVD) 효소에 의해 IPP로 전환된다.IPP는 isopentenyl pyrophosphate isomerase (IPI) 효소에 의해 이중 결합 이성질체인 dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP)로 전환된다.

2.2.2 골격의 형성 24,25-epoxygulldienol

Geranyl pyrophosphate synthase(PS)는 IPP 및 DMAPP 으로부터 Geranyl pyrophosphate (GPP)의 형성을 촉매한다.그런 다음 Farnesyl pyrophosphate synthase(FPPS)는 IPP 한 분자로부터 Farnesyl pyrophosphate (FPP)의 합성을 촉매합니다.FPP는 스쿠알렌synthase (SQS)에 의해 스쿠알렌(SQ)로 변환된다.SQS는 두 개의 FPP 분자가 응축되는 것을 먼저 촉매하여 pre-squalene diphosphate (PSPP)를 형성하고, NADPH와 Mg2+[44]가 있는 상태에서 PSPP를 SQ로 전환시키는 이중 기능성 효소이다.

오랫동안 과학자들은 squalene epoxidase(SQE) 가 SQ의 1단계 반응을 촉매하여 선형 2,3-epoxysqualene을 형성하고, 이것이 cyclase에 의해 순환되어 골격 물질인 ulipristal[49]을 형성한다고 믿었다.그러나 최근의 연구에 의하면 아글리콘의 전구체는 cucurbitadienol이 아닌 24,25-epoxylup-20(29)-en-3-ol 이며, 전구체는 2,3-epoxysqualene이 아닌 2,3;22,23-diepoxysqualene이다.SQ는 순서대로 SQE에 의해 촉매된 2,3-epoxysqualene, 2,3;22,23-dioxosqualene을 생성하며, 후자는 cucurbitadienolsynthase (CDS) [32]의 촉매 하에 24,25-epoxygulustrenol로 순환된다.

모핵인 모그로사이드의 생산 및 개조 2.2.3

쿠쿠르비탄 테트라사이클릭 트리테르페노이드 모그로사이드의 고유한 특징은 C3, C11, C24 및 C25위치에서 부위별 산소 발생으로 모핵 모그로사이드를 형성한다 [32].따라서 모핵합성의 단계를 규명하는데 있어서 가장 큰 어려점은 그것의 독특한 히드록실화, 특히 C24와 C25위치의 트랜스 히드록실화이다.Itk에서등 [32]은 epoxide hydrolase (EPH) 가 24,25-epoxylup-20(29)-en-3-one의 C24 및 C25위치의 히드록실화를 촉매하여 trans-24,25-dihydroxylup-20(29)-en-3-one을 생성하고, 이는 CYP87 계열의 일원인 CYP87D18(CYP102801)에 의해 C11위치에서 히드록실화되며,[50]cytochrome P450 효소 (CYP450) 시스템에서 lupeol을 생성한다.히드 록실 화 반응의 순서도 제안되었다:EPH 단백질은 linear 2,3;22,23-diepoxysqualene 보다는 epoxylup-20(29)-en-1-ol에 결합하는 경향이 있으므로 EPH 반응은 CDS 순환 반응을 따른다;C11에 추가적인 친수성 히드록실기는 EPH 소수성 주머니에서 도킹을 방지하므로 EPH 반응 후에 C11 히드록실화 반응이 일어난다.

M5 합성의 마지막 단계는 모 그로사이드의 C3 및 C24위치의 당화 변형입니다.C24위치에서의 당화는 기질과 글리코실 트랜스퍼라제를 도킹함으로써 C3위치에서의 당화에 대한 친화도를 증가시킨다는 것을 발견하였다.glycosylation의 순서에 따라 결정었패턴의 축적 Mogrosides:Mogroside에 의해 처음으로 C24 위치에 기본 glycosylation를 겪을 glycosyltransferaseUGT720-269-1을 생성 Mogroside Ⅰ-A1;후자는 다음에 의해 C3 위치에 glycosylated을 생성하는 UGT720-269-1 mogrosideⅡ E;이어서 UGT94-289-3은 C3와 C24위치에서 포도당 사슬의 분지형 당화를 담당하며, 테트라당류 중간체가 합성되어 M5[32]를 형성한다.

모그로사이드 V 합성 생물학 예비 연구 3

설탕을 첨가하지 않는 천연 감미료로서 단백질 감미료인 타로감미료의 미생물 생산은 오랜 연구 역사를 가지고 있으며, 다양한 미생물 [51-53]에서 이루어졌으나 수율은 낮다.스테비오사이드의 생합성 경로는 2013년에 완전히 해명되었다 [54].현재 stevioside 산물의 발효 및 합성은 주로 rebaudioside 한,rebaudioside D,rebaudioside M [55-56] 등이 보고되고 있으나, 수율은 낮은데, 이는 구축된 합성 경로가 비교적 길기 때문이다.

2016년 수 (Xu)등 (57)은 리코리스로부터 글루쿠론산 전이동효소 GuUGAT (UGT73 계열에 속함)을 보고하여 글리시리지산의 2단계 글루쿠론산 당화를 촉매하여 글리시리지산을 형성함으로써 글리시리지산 생합성의 완전한 경로를 밝혔다.이 춘 교수 's 연구단 [58]은 glycyrrhizic acid를 생산하는 조작된 세균을 기본으로 사용하고 human glycosyltransferaseUGT1A3 유전자, human UDP-포도당dehydrogenase UGDH (Hs) 유전자, Escherichiacoli 유래 UGDH (Ec) 유전자를 도입하여 glycyrrhizic acid를 생산하는 재조합 세균을 얻었다.Mogroside와 long pathway의 생합성 경로에 대한 늦은 해명으로 인해 M5의 합성생물학에 대한 연구는 제한적이다.

섀시 셀의 선택 및 최적화 3.1

섀시 셀은 천연 제품의 합성을 위한 공장입니다.성숙한 운영 체제와 유전적 안정성을 갖춘 섀시 셀의 선택은 천연 제품의 효율적인 생산을 위한 기반입니다.모델 미생물인 Escherichia coli와 Saccharomycescerevisiae는 섀시 세포로 자주 사용된다.Saccharomycescerevisiae는 M5와 같은 복잡한 천연 산물의 이형 합성 연구에 독특한 장점을 가지고 있다:내인성의 MVA 경로와 ergosterol 합성 경로는 전구물질인 IPP, DMAPP 및 2,3-epoxy-squalene을 안정적으로 제공할 수 있으며 [59-60], 완전한 막 시스템과 전환 후 변질은 cyclase 및 CYP450의 활성 발현에 도움이 된다.2,3-epoxysqualene은 식물의 트리테르페노이드 및 스테롤 골격을 합성하기 위한 일반적인 전구체이다 [61].그러나 감미료의 생합성에서 골격 합성을 위한 전구체는 2,3;22,23-diepoxysqualene이다.Saccharomycescerevisiae에서 내인성 스쿠알렌 epoxidase(ERG1)는 2,3-epoxysqualene을 2,3;22,23-bisepoxysqualene [32,62]으로 산화시킬 수 있으며, 이는 Saccharomyces cerevisiaeERG1이 SgSQE를 대체할 수 있음을 의미한다.

Saccharomyces cerevisiae 세포에 있는 2,3-epoxysqualene의 대부분은 lanosterol synthase (ERG7) [63]를 통해 ergosterol 합성 경로로 들어가 mogroside 전환으로의 대사 유동을 위해 경쟁한다.Saccharomyces cerevisiae 균주 GIL77은 [64]ERG7의 부족으로 인해 고농도의 2,3-에폭시스칼렌을 축적하며 모그로사이드 합성과 관련된 효소의 기능을 확인하기 위한 섀시 세포로 자주 사용된다.triterpene sapon에서합성에 대한 생물학적 연구가 지속적으로 진행됨에 따라 Saccharomyces cerevisiae를 최적화하여 다량의 2,3-epoxysqualene을 축적하는 전략이 점차 개선되었다.주로 다음과 같다:1) MVA 경로에서 테르펜 합성과 관련된 유전자의 과발현 [65-66];2) ergosterol synthase 억제제인 R0 48-8072 또는 CRISPR/dCas9시스템을 이용하여 ERG7 [32,63]의 발현을 억제하고, ergosterol 합성분지를 하향조절한다;3) 전역 전사 인자 UPC2의 돌연변이 유전자 upc2-1을 이용하여 MVA 경로와 관련된 유전자의 전사 효율을 직간접적으로 상향조정한다 [67].

주요 효소 유전자의 클로닝 및 발현 3.2

미생물 세포에서 M5의 de 새로합성을 달성하기 위해서는 주요 효소 유전자들이 이형적으로 조합되어야 한다.따라서 효소 유전자의 클로닝은 이형어셈블리를 위한 부분을 제공할 것이며, 효소의 이형발현은 기능성 연구의 토대를 마련할 것이다.지금까지 복제되어 발현된 주요 효소는 SQE, CDS,EPH,CYP450 그리고 glycosyltransferase이다.

스쿠알렌 에폭시다제3.2.1

스쿠알렌 에폭시다제는 많은 triterpenoid synthase 계에서 보고된 스쿠알렌의 이중 에폭시화를 수행하며 [68-70], 기능적으로 발현된 식물 스쿠알렌 에폭시다제는 모노 및 디-산화 스쿠알렌을 동시에 생성 할 수 있다 [62,71].2018년, 자 오Huan et알다.[72]은 Luo Han Guo의 SQE 유전자로 주석이 붙은 두 개의 전장 조각들을 복제하였고, 둘다 524개의 아미노산을 암호화한 1,575 bp의 완전한 개방 판독 프레임을 포함하고 있으며, 각각 SgSQE1과 SgSQE2 라고 명명하였다.SgSQEs에 의해 암호화된 단백질 서열의 n-말단은 모두 transmembrane domain을 가지고 있기 때문에 원핵생물에서 발현될 때 비활성 포함체로 존재하며 효소 활성을 확인할 수 없다.단백질 기질의 분자 도킹은 SgSQEs 가 리간드 2,3-에폭시 퀄렌과 상호작용하여 수소 결합을 형성할 수 있음을 의미하며, bis-에폭시 퀄렌을 생성하는 기능을 가지고 있을 것으로 추측된다.이후 Itk에서등 [32]은 SgSQE 단백질을 모델링하여 제1에폭사이드가 있어도 제2에폭시화의 도킹을 막지 못함을 보여 SgSQE 가 이중 에폭시화 반응을 겪을 수 있음을 알 수 있었다.

쿠쿠르비타디에놀 합성효소 3.2.2

2,3-에폭시스퀄렌은 피토스테롤과 트리테르펜 [73]의 골격을 이루는 서로 다른 종류의 산화스콸렌시클로아제 (OSC)의 촉매작용하에 양성자, 순환화, 재배열 및 탈양성자에 의해 형성된다.따라서 서로 다른 종류의 OSC 끼리 경쟁을 하게 된다.OSC 계열에 속하는 CDS는 모그로사이드의 합성에서 핵심적인 cyclase이다.그것의 발현 및 활성은 mogroside의 생산량을 결정하는 2,3-epoxysqualene의 mogroside 로의 전환의 대사 흐름에 영향을 미친다.

Dai등 [74]은 Luo Han Guo의 RNA 염기서열 분석 (RNA-seq)과 디지털gene expressi에profiling (DGE) 분석을 통해 sgcd를 확인하였다.cDNA는 길이가 2,800 bp 이고 2,280 bp의 ORF를 포함하고 있으며, 84.4 kDa의 예측분자량을 가진 759개의 아미노산을 가진 단백질을 암호화하고 있다.이어서 2,3-epoxysqualene을 cucurbitadienol로 순환시킬 수 있는 효모 균주 GIL77을 이용하여 SgCDS의 순환능을 확인하였다.이는 Mogroside cyclizing 2,3;22,23-diepoxysqualene이 24,25-epoxy-squalene을 생성하는 생합성 경로의 SgCDS와 일치하지 않는 것으로 보인다 (그림 2) 실제로 Itk에서등 [32]은 Saccharomyces cerevisiae와 담배 Nicotiana tabacum L을 변형시켜 SgCDS를 기능적으로 분석한 결과 SgCDS는 2,3;22,23-bisepoxysqualene 뿐만 아니라 2,3-epoxysqualene을 cyclize 하여 squalene을 만들 수 있다는 것을 발견하였으나, 후자가 Mogroside의 합성에 관여하지는 않는다.이상의 연구를 통해 2,3-에폭시 퀄렌의 경우, SgCDS의 순환화가 ERG1의 에폭시화에 선행하여 SgCDS는 주로 2,3-에폭시 퀄렌의 순환화 기능을 나타내 주는 것으로 나타났다.

CYP450과 글리코실트랜스퍼라제3.2.3

CYP450은 테르펜, 플라보노이드, 알칼로이드, 리그닌 [75]과 같은 천연 산물의 산화에 핵심적인 역할을 하는 식물의 유전자 상과이다.엄격한 기질 특이성과 낮은 시퀀스 유사성을 가지고 있습니다.글리코실트랜스퍼레이스는 두 번째로 큰 식물효소계열 1UGTs의 구성원일 수 있으며, 이들은 다른 당 또는 당을 다른 수용체로 전달하며, 다른 글리코실트랜스퍼레이스를 필요로 한다 [76].따라서 특정 대사산물의 생합성을 촉매하는 CYP450과 glycosyltransferase 유전자를 효율적으로 발견하여 복제하는 것은 상대적으로 어렵다.탕등 (77)은 개화 후 50~70 d 이후 빠르게 축적되는 M5와 결합하여 RNA-seq와 DGE의 혼합 응용을 바탕으로 7개의 CYP450s와 5개의 udpg를 M5의 합성을 담당하는 후보 유전자로 확인하고 screening 하였다.이 방법은 비모델 식물에서 새로운 2차 대사산물의 생합성을 담당하는 후보 유전자를 식별하는 효과적인 방법을 만들었다.

장등 [50]은 Luo Han Guo에서 다기능성 cytochrome P450 효소 (CYP87D18)와 glycosyltransferase (UGT74AC1)를 확인하였다.In vitro 효소 활성 검사 결과 CYP87D18은 furostanol의 C11위치의 산화를 촉매하여 11-oxofurostanol과 11-hydroxyfurostanol을 형성하는 역할을 하는 것으로 나타났다;UGT74AC1은 구체적으로 로가니놀의 C3위치로 포도당을 이동시켜 로가닌 IE를 형성할 수 있다.거의 동시에 Itk에서등 [32]은 모모디카그로베노리에서 191개의 CYPs와 131개의 UGTs를 확인하였고, 개발 과실에서 발현되는 40개의 CYPs와 100개의 UGTs를 사전 검사하였다.기능성 검증은 효모와 대장균에서 각각 수행하였다.그 결과, CYP87D18 (CYP102801)은 트랜스-24,25-디 히드 록시 cholest-4-en-3-one의 C11위치의 히드 록시 화를 촉매하여 로스 몰산을 생성하고;UGT74-345-2, UGT75-281-2, UGT720-269-1 및 UGT720-269-4는 C3위치에서 1차 당화를 담당하며, UGT720-269-1은 C24위치에서 1차 당화를 담당하는 유일한 효소이기도하다.UGT720-269-1, UGT94-289-1, UGT94-289-2 및 UGT94-289-3은 C3 및 C24포도당 사슬의 분지된 당화를 담당한다.

쿠쿠르비타디에놀의 생합성 3.3

이소연 등 [78]은 실험실에서 얻은 트리테르페노이드 화합물을 이용하여 효모 차체균주인 WD-2091에서 클로닝 된 SgCDS를 이형적으로 발현하여 발효시켰으며 (FPS,SQS,SQE 및 MVA 경로는 과발현 및 조절), 클로닝 된 SgCDS는 이형적으로 발현되어 발효되었으며 쿠쿠르비타디에놀의 수율은 27.44 mg/L 이었다.CDS 유전자는 고복사의 플라스미드 pRS425에서 저복사의 플라스미드 pRS313으로 더욱 이동하여 CDS 유전자의 발현을 조절하였으며, 313-SL-CB Saccharomyces cerevisiae 세포공장을 얻었으며, 쿠커비타디에놀의 생산이 202.07% 증가하였다.고밀도 발효 수율은 1,724.10mg/L에 달하였으며, 이는 현재 쿠쿠르비타디에놀의 미생물 합성 중 가장 높은 수율이다.이번 연구로 쿠커비트형 테트라사이clic 트리테르페노이드 생산을 위한 효율적인 세포 공장을 만들 수 있는 토대가 마련됐다.

M5를 위한 미생물 세포 공장의 건설은 원래의 생합성 경로를 이전하거나 전체 대사 경로를 재공학 및 건설하는 것을 포함할 수 있다.쿠쿠르비타디에놀이 로가닌의 합성을 위한 골격이 아니라는 것이 입증되었지만, 쿠쿠르비타디에놀을 고농도로 생산하는 공학된 세균 313-SL-CB는 차대세포로 사용될 수 있다.oxidase 유전자를 재결합하여 쿠쿠르비타디에놀을 24,25-epoxycucurbitadienol로 전환한 후 EPH,CYP450 및 글리코실트랜스페라제에 의해 촉매되어 M5를 생성할 수 있다 (그림 3).

논의 및 전망 4

피플 &의 개선으로#39;의 건강에 대한 인식, 소비자 '음식에 대한 추구는 더 이상 그들의 미뢰를 만족시키는 데 국한되지 않고, 건강과 기능성에도 점점 더 관심을 기울이게 되었고, 이로 인해 무설탕 천연 감미료 [30]에 대한 수요가"폭발적인"증가하게 되었다.특히 월드 & 중 하나인 M5#39;의 가장 강한 천연 감미료, public&를 만날 뿐만 아니라#39;s는 천연 비 설탕 감미료로서 요구, 그러나 약효로 인해 당뇨병 환자와 비만 사람들의 자당 대용으로 쓰이기도 한다 [79].M5의 수요는 전세계적으로 점차 증가하고 있으며 [80], 식물 추출 방법으로는 더 이상 시장의 수요를 충족시킬 수 없다.합성 생물학은 천연 식물 산물의 효율적이고 지속 가능한 추출에 독특한 장점을 가지고 있으며, 다양한 천연 산물의 합성에 응용되고 있다 [81-83].따라서 합성생물학을 이용한 M5의 대규모 생산은 피할 수 없는 추세이다.현재 M5의 생합성 경로는 완전히 해명되었고, 주요 효소들이 복제되어 기능적으로 검증되었지만 미생물 생산에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.

합성생물학의 원리를 바탕으로 M5세포 공장 건설을 위한 두 가지 전략을 제안합니다:먼저, 위에서 언급한 바와 같이 (그림 3), 가장 편리한 방법인 높은 생산량의 쿠쿠르비타디에 놀 생산 공학적 박테리아 313-SL-CB를 기반으로 M5로의 형질전환이 가능합니다;둘째,2,3;22,23-dioxo-squalene을 M5로 전환하는데 관여하는 5개의 효소 유전자를 효모세포에 재결합하여 de novo 합성을 할 수 있다 (도 2).이 두 가지 전략을 이용하여 M5 활성 분자의 미생물 생산을 실현하는 데에는 아직 많은 어려움이 있는데, 첫째, 첫 번째 전략에서 스쿠알렌이 24,25-epoxysqualene으로 산화하는 촉매작용을 하는 효소가 발견되지 않았고, 두 번째 전략인 yeast's 내인성 ERG1, SgCDS에 충분한 2,3;22,23-bisepoxysqualene을 제공할 수 없다.둘째, M5 생합성 경로에는 많은 효소와 중간체가 관여하고, 대사과정이 복잡하며, 하나의 미생물 세포에 통합된 외인성 유전자의 효율적이고 조직적인 발현이 어려우며, 또한 숙주에 더 큰 대사압력을 유발한다.마지막으로 SgCDS, UGT720-269-1 및 UGT94-289-3은 모두 다양한 기질에 작용하여 서로 다른 생성물을 형성할 수 있는 비특이적 효소이며, 차체세포에서 촉매작용의 순서와 방향은 제어하기 어렵다.

문제점을 해결하기 위해, 우리는 다음과 같은 전략을 제안한다:에폭시 화 반응을 효율적으로 촉매하는 lupeol 및 SQEs 로부터 24,25-epoxylupeol의 생산을 촉매하는 산화효소를 식별하고 걸러낸다;더 정확하게 2,3-에폭시 스쿠알렌의 하류 경로를 조절하고 2,3-에폭시 스쿠알렌은 더 mogroside의 합성쪽으로 향합니다.최근 모듈식 공동 재배 공학은 세포 스트레스를 줄이고 목표 산물의 생산을 증가시키기 위한 새로운 전략이 되었다 [84-85].따라서, M5의 생합성 경로는 서로 다른 모듈로 합리적으로 분할될 수 있으며, 각 모듈은 특정 균주로 통합될 수 있다.모집된 균주를 한 공간에 집적시킨 후, 모집된 균주를 공동 배양하여 M5의 de novo 합성을 달성할 수 있다.구조 생물학은 효소 단백질의 구조를 분석하고 특정한 촉매 메커니즘을 이해하는 데 사용되며, 파르네실 전달 효소와 글리코실 전달 효소의 기질 특이성은 적절한 효소 변형을 통해 향상된다.주요 화합물 실시간 모니터링 및 대사 동적조절 기술을 개발하여 효소의 지시성 촉매화를 달성한다.합성생물학과 대사공학의 발달로 M5의 저비용 대규모 생산이 반드시 실현될 것이다.

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